Detección serológica y caracterización molecular de Potato virus S (PVS, Carlavirus) en cultivos de papa de Colombia Detection and molecular characterization of Potato virus S (PVS, Carlavirus) from Colombia
José Fernando Gil1*, José Miguel Cotes2* & Mauricio Marín1
In Colombia, potato crops are affected by a wide variety of viruses such as PVY, PLRV, PVX, PMTV and PVS. Unfortunately, there are very few studies on the biology, distribution and pathogenicity of these viruses; this situation is even worse for the latent virus PVS. In this work, we evaluated the presence of PVS in four Colombian provinces (Antioquia, Boyacá, Cundinamarca, Nariño) by the use of ELISA. We also studied the degree of molecular variation by sequence comparison of a segment of the gene encoding for the viral coat protein. In average, PVS was detected in 40% of 320 analyzed samples of potato leaves; the highest levels were observed in the East of Antioquia (49%) and Pasto (Nariño) (47%), while in the other regions ranged between 35% and 42%. Analysis of sequence revealed the presence of two PVS strains in Colombia: three isolates were associated to PVSO (Ordinary) and twelve belonged to PVSA (Andean). A high diversity was observed among PVSA strains with percent identities in the range of 88-99%. These findings highlight the importance of strengthening seed certification programs and quarantine measures in Colombia for viruses like PVS, which can cause losses of up to 20% in potato crops and even higher in mixed virus infection.
El cultivo de papa en Colombia es afectado por diversos virus, que incluyen PVY, PLRV, PVX, PMTV y PVS; aunque se han realizado pocos estudios sobre la biología, distribución y patogenicidad de dichos virus en Colombia, siendo especialmente escasa la información referente al PVS. En este trabajo se evaluó mediante pruebas de ELISA, la presencia del PVS en cuatro departamentos de Colombia, así como sus niveles de variación, a partir de la secuenciación de una porción del gen de la cápside viral. Los resultados indicaron una detección promedio del virus en el 40% de las 320 muestras analizadas, con zonas como el Oriente cercano de Antioquia (49%) y Pasto (Nariño) (47%), donde se detectó en mayor proporción el virus. Los análisis de variación molecular indicaron la presencia de las dos razas de PVS (Ordinaria y Andina) en Colombia, siendo los aislamientos de PVSA los más diversos, al presentar un rango de identidad del 88 al 99%. Estos hallazgos indican que es imperativo el fortalecimiento de los programas de certificación de semilla y vigilancia cuarentenaria en el país, especialmente para virus como el PVS, que aunque puede ser asintomático, causa pérdidas hasta del 20% en cultivos de papa.
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El Potato virus S (PVS) es un miembro del género Carlavirus, familia Betaflexiviridae, que incluye seis géneros y 66 especies de virus (Adams & Kreuze 2008, ICTV 2012). Este virus presenta forma filamentosa de 610- 710nm y un genoma de ARN de cadena sencilla con orientación positiva (ARNss+) de cerca de 8 500 nucleótidos (nt). El extremo 5´del ARN está protegido con una caperuza y el 3´tiene una cola de poli-Adenina. El genoma codifica para seis ]]>
et al. 2005, Lin et al. 2009, Salari et al. 2011).
El PVS es considerado como uno de los virus que dependen de la papa (Solanum tuberosum) para su supervivencia y diseminación, ]]>
et al. 2011). Sin embargo, sus niveles de incidencia pueden alcanzar hasta el 100% en un cultivo o región, gracias a su eficiente transmisión mecánica, por tubérculos-semilla y por áfidos ]]>
et al. 1989). A pesar de la condición latente de este virus, se ha estimado que puede ocasionar pérdidas en los cultivos de papa, que oscilan entre un 10 y 20% (Rose 1983, Dolby & Jones 1987, Jeffries 1998). Adicionalmente, el PVS presenta una reacción sinérgica con otros virus como el Potato virus X (PVX), que conduce a que ocasione síntomas más severos, aumente su tasa replicativa y por ende, cause un mayor efecto detrimental sobre el número total de tubérculos producidos por las plantas (Nyalugwe et ]]>
2012).
Tradicionalmente, se han descrito dos razas de este virus: PVSO y PVSA (Ordinaria y Andina, respectivamente), con base en su reacción diferenciada (local o sistémica) sobre plantas indicadoras de Chenopodium quinoa; sin embargo, la denominación de las razas no implica su ocurrencia en una ]]>
et al. 1989, Matoušek et al. 2000, Cox & Jones 2010). Las identidades en porcentaje de nt entre ambas razas, en las secuencias que codifican para la proteína de cápside (CP) y la proteína de 11kDa son de 81% (93% para aminoácidos (aa)) y 83% (77% para aa), respectivamente (Lin et al. ]]>
et al. 2000).
PVSA induce síntomas más severos en las plantas infectadas, incluyendo senescencia prematura y pérdida de hojas ]]>
Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Aphis fabae y A. nasturtii sus vectores principales (Wardrop et al. 1989, Lambert et al. 2012). Estudios recientes han encontrado variantes de ]]>
O con capacidad de generar una invasión sistémica en C. quinoa, pero que son filogenéticamente distantes a PVSA (Matoušek et al. 2005, Lambert et al. 2012) y que por tanto, han recibido la denominación de VSO-CS (CS: Chenopodium systemic). Sin embargo, se desconoce la existencia de aislamientos de PVSA ]]>
En Colombia, los estudios de genotipificación e incidencia de virus en cultivos de papa son muy escasos. Sin embargo, los pocos realizados indican altos niveles de infección de Potato virus Y (PVY) (Gil et al. 2011a) y
Potato leafroll virus (PLRV) (Gil et al. 2011b) en cultivos de las principales regiones productoras de papa en este país, así como en la Colección Central Colombiana (CCC) de papa, una colección de germoplasma que consta de cerca de 2 900 accesiones de S. tuberosum subespecies andigena y tuberosum,
S. phureja, S. chaucha y especies silvestres como S. colombianum y S. estradae (Corpoica 2005). En este sentido, en un estudio que evaluó mediante pruebas de inmunoimpresión el estado de sanidad viral de algunas accesiones de la CCC, se encontró que el virus más prevalente entre las 34 accesiones bajo estudio fue PVS, con un 61.3% de detección (Franco-Lara
et al. 2009); mientras que Gúzman et al. (2010) encontraron a partir de pruebas de DAS-ELISA, que el 85% de las 585 accesiones evaluadas presentaban reacción positiva con anticuerpos específicos para PVS. Estos autores también encontraron que PVS no se encontraba como el único virus afectando las accesiones, sino que en la mayoría de casos, hacía parte de complejos virales con Potato virus X (PVX), PVY y PLRV, por lo que no se ]]>
Materiales y métodos
Detección ]]>
Para esta evaluación se realizó, muestreos aleatorios en ocho cultivos de S. tuberosum ssp. andigena de las variedades Capiro, Parda Pastusa, Esmeralda, Suprema, Unica, Nevada, y de S. phureja variedad Criolla Colombia, ubicados en tres zonas productoras del departamento de Antioquia y Cundinamarca y en dos zonas de Boyacá y Nariño, ]]>
Cuadro 1). En cada cultivo se realizó una colección aleatoria de cuatro muestras conformadas por dos folíolos jóvenes del extremo apical de las hojas, para generar una muestra compuesta. Las muestras se secaron a temperatura ambiente, se empacaron en bolsas plásticas selladas y se enviaron por servicio de courier al laboratorio para su conservación a -80°C.
En todos los casos, el período transcurrido entre la colecta y almacenamiento de las muestras no superó las 24hr. Las 320 muestras (4 muestras x 8 cultivos x 10 zonas) se evaluaron para la detección de PVS mediante pruebas de DAS-ELISA con anticuerpos policlonales de la compañía Agdia (Indiana, USA), siguiendo las instrucciones del ]]>
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Los resultados fueron analizados a través de un modelo lineal generalizado aleatorio considerando una distribución binomial para la variable presencia de virus y utilizando una función de ligamiento logit. Para el análisis de los datos se consideraron d departamentos (i=1,2,…,d); mi zonas dentro de departamentos (j=1,2,…,b; ]]>
i), Fij lotes dentro de zonas y departamentos (k=1,2,…,c; donde c=ΣΣFij), y n observaciones totales. Así para el vector y de observaciones de presencia/ausencia de PVS, en la planta l del lote k dentro de la zona j del departamento d, se consideró el siguiente modelo lineal generalizado (Littell et al. ]]>
et al. 2008):
donde, en su orden, 1 y μ son el vector de unos de tamaño n y la media general; Z1 y u1 son la matriz de presencia n×a y el vector a×1 de efectos aleatorios de departamento, Z2 y u2 son la matriz de presencia n×b y el vector b×1 de efectos aleatorios de zonas dentro de departamentos, Z3 y u3 son la matriz de presencia n×c y el vector c×1 de efectos aleatorios de lotes dentro de zonas y departamentos; y e es el vector de efectos residuales. En este estudio se supone que el vector y sigue una distribución de Bernoulli, y que los efectos de departamentos, zonas dentro de departamentos, y lotes dentro de zonas y departamentos siguen una distribución normal con media cero y varianza σ2u1, σ2u2 y σ2u3. Para la predicción de la presencia () se utilizó el mejor predictor lineal insesgado (BLUP, por sus siglas en inglés) para el efecto respectivo, usando la siguiente expresión:
Para el análisis estadístico se utilizó el procedimiento GLIMMIX del ]]>
Variabilidad genética de aislamientos de PVS: El ARN molde necesario para amplificar un fragmento del gen de la proteína de la cápside de PVS por medio de la técnica de RT-PCR se obtuvo a partir de extracciones de ARN total de una mezcla de folíolos de papa que fueron positivos a la prueba de ELISA, ]]>
RNeasy plant mini (Qiagen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos con los cebadores PVSCPF (5’- CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3’) (Ali et al. 2008) y PVSR (5’-ATG ATC GAG TCC AAG GGC ACT G-3’), que están dirigidos a regiones conservadas del gen CP de PVS y por tanto amplifican una porción de este gen en variantes ordinarias y andinas de este virus (Nie & Singh 2001, Ali et al. 2008). ]]>
QIAquick Gel Extraction (Qiagen) y secuenciados en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied ]]>
Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit 6.0.6 (Hall 1999), construyéndose secuencias consenso y confirmándose su identidad con genes virales por comparación con las bases de datos moleculares mediante BLAST. El alineamiento incluyó las secuencias obtenidas en el estudio y aquellas depositadas en el GenBank ]]>
software Clustal W (Larkin et al. 2007) y se realizó un análisis filogenético mediante el método de Máxima Parsimonia utilizando el software MEGA versión 5.0 (Tamura et al. 2011). El soporte de la topología interna de los dendrogramas fue determinado por análisis de bootstrap con 1 000 ]]>
et al. 2004) mediante el software MEGA versión 5.0 (Tamura et al. 2011).
Resultados
Evaluación de la presencia de PVS: Los resultados de los análisis serológicos indicaron la presencia promedio del 40% del PVS en los cuatro departamentos evaluados, siendo las muestras de los cultivos de papa de ]]>
Fig. 1). Dentro de los departamentos, las muestras de las regiones del Oriente Cercano de Antioquia y Pasto (Nariño) fueron en su orden las que tuvieron mayor presencia del virus, con 49 y 47%, respectivamente. Las demás zonas presentaron niveles de detección de PVS entre 35 y 42% (
Fig. 1).
Variabilidad genética de aislamientos de PVS: Las pruebas de RT-PCR produjeron los amplicones del tamaño esperado (~629pb) con los cebadores PVSCPF y PVSR. El análisis de variabilidad genética se realizó ]]>
Cuadro 2) y 28 secuencias de referencia obtenidas del GenBank, representando diferentes razas y orígenes geográficos del virus (Fig. 2). Así mismo, se utilizó como grupo externo una secuencia de CP de la especie tipo del género Carlavirus, ]]>
Carnation latent virus (CLV) (Accesión X52627). El dendrograma resultante generó dos grandes clados que representan las razas PVSO (25 aislamientos de referencia y tres de Colombia) y PVSA (tres aislamientos de referencia y 12 de Colombia), y se presentan fuertemente respaldados por valores de bootstrap del 97 y 96%, respectivamente (Fig. 2). ]]>
bootstrap (ej. IV, VI). Tres de los aislamientos colombianos de PVS se presentaron en el clado I de PVSO, en conjunto con un aislamiento de Reino Unido y uno de Australia, mientras que los demás clados incluyeron indistintamente aislamientos de PVS obtenidos en Europa, Australia y Asia. Sin embargo, los aislamientos representativos de EEUU sólo se presentaron en el clado III. ]]>
Por otra parte, el grupo representando la raza Andina de PVS, se subdividió en tres subclados (I, II y III) (Fig. 2), con los dos primeros emparentados filogenéticamente, aunque con un mediano soporte de bootstrap (81%). El primer subclado (I) sólo incluyó aislamientos colombianos de PVS procedentes de cultivos ]]>
A procedentes de India, Perú y República Checa. El subclado III presentó la mayor proporción de aislamientos colombianos de PVS (8 de 15 secuenciados), procedentes de todas las zonas cultivadoras de papa bajo análisis.
El análisis ]]>
A de 0.17 (nt) y 0.42 (aa).
Al evaluar los niveles de identidad ]]>
A. Estos valores fueron superiores a 91% (máximo de 99%) para todos los aislamientos PVSO (colombianos e internacionales), mientras que para las secuencias bajo estudio de los aislamientos de PVSA, se encontraron valores de identidad de 88 a 99%. ]]>
La identidad de los aislamientos de PVS con respecto al CLV, utilizado como grupo externo de análisis fue de 43 a 48%.
Discusión ]]>
El cultivo de la papa en Colombia, participa con el 7.1% de la superficie sembrada en cultivos transitorios (128 701ha), aporta cerca de 7.8% de la producción agrícola con un volumen de 2 272 772ton/año y genera alrededor de 69 000 empleos directos (MADR 2009). Uno de los principales aspectos que afectan la producción de este cultivo son los problemas virales, sin embargo, el nivel de conocimiento que se ]]>
Los resultados encontrados a partir de 320 muestras de plantas obtenidas en 10 zonas de cultivo de los cuatro principales departamentos productores de papa de Colombia, indicaron altos niveles de detección del virus, con un promedio general del 40% y departamentos como el de Cundinamarca y Antioquia, cuyas muestras en conjunto presentaron niveles de detección de 58 y 45%, respectivamente. En Colombia, no se contaba con antecedentes ]]>
et al. 2009) y 85% (Guzmán et al. 2010), respectivamente. Dichos hallazgos, así como los aquí encontrados, ]]>
et al. 2012, Nyalugwe et al. 2012), que incrementan las pérdidas en la producción de papa.
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Por otra parte, trabajos recientes adelantados por nuestro grupo (Gil et al. 2011a, b), tendientes a evaluar la presencia de PVY y PLRV en las mismas regiones analizadas en este estudio, determinaron que dichos virus alcanzaron niveles de presencia promedio del 72% y 20%, respectivamente. Lo anterior sugiere que es imperativo el establecimiento de un esfuerzo nacional en los organismos de sanidad vegetal estatal, agremiaciones de productores y agroindustrias de alimentos, para implementar prácticas que ]]>
Con respecto al análisis de variabilidad genética realizado a partir de la secuenciación de una porción del gen CP de 15 aislamientos colombianos de PVS, y su comparación con cepas de referencia de otros países del mundo, fue posible la detección e identificación en el país de las dos ]]>
O y PVSA, siendo la última aparentemente la más registrada, al incluir 12 de los 15 aislamientos secuenciados. En este caso, cepas de la raza A se encontraron a partir de muestras de Antioquia, Nariño y Cundinamarca, mientras que PVSO fue detectado en Boyacá y Cundinamarca. Sería importante en el futuro adelantar trabajos locales que permitan definir si en dichas regiones se presentan indistintamente ambas razas ]]>
Trabajos similares al aquí presentado, que evalúan los niveles de diversidad de PVS con base en secuencias de CP, han encontrado una base genética más estrecha para los aislamientos de PVS caracterizados en diferentes regiones. Así por ejemplo, Salari et al. ]]>
O y que su diversidad global oscilaba entre 92.5 y 99.1%; mientras que Lambert et al. (2012) evaluando la variabilidad genética de aislamientos de PVS obtenidos en cultivos de papa de Tasmania (Australia), encontraron que éstos compartían niveles de identidad superiores al 95%, independientemente de causar infecciones ]]>
O) sobre C. quinoa. Similarmente, Lin et al. (2009) evaluaron las secuencias completas de dos aislamientos de PVS de EEUU, y encontraron que éstos compartían una identidad global para todo el genoma de 98% y de 98.6% para el gen de CP.
Por otra parte, ]]>
A de Colombia, amplía el conocimiento sobre rango de variación de esta raza de PVS en el mundo, por cuanto en la mayor parte de estudios de diversidad hasta ahora realizados, siempre se utilizaban un máximo de cinco aislamientos, con tan sólo dos procedentes de la zona Andina de Perú (D00461 y BAA00355), mientras que los otros fueron obtenidos en India (FJ643622), Reino Unido (AA085502) y República Checa (CAI06112). Así mismo, de gran interés resultaron los altos niveles de diversidad encontrados ]]>
C. ]]>
, por cuanto desde el registro original de la raza PVSA por Hinostroza-Orijuela (1973) y su confirmación posterior a partir de un aislamiento encontrado en cultivos de papa de Wisonsin (EEUU) por Slack (1983), se ha considerado que a diferencia de PVSO, esta raza tiene la capacidad de inducir infecciones sistémicas en dicho hospedante experimental. Sin embargo, los estudios iniciados por Matoušek et al. (2000) y recientemente confirmados por Cox & Jones (2010) y Lambert
et al. (2012), encontraron que algunos aislamientos de PVSO tenían la capacidad de inducir síntomas en hojas no inoculadas de C. quinoa, aunque se desconoce hasta el momento la existencia de aislamientos de PVSA que sólo induzcan lesiones locales en este hospedante.
Los resultados de ]]>
et al. 2000, Lin et al. 2009). Esto servirá como base para el ]]>
El hecho que en ]]>
A, implica que además de la transmisión por contacto y por tubérculo-semilla que presenta este virus, su dispersión por diferentes especies de áfidos (Wardrop et al. 1989), puede jugar un papel importante en la distribución del virus dentro y entre los lotes de cultivo de las diferentes ]]>
Los hallazgos presentados en este trabajo y otros realizados recientemente para PVY y PLRV (Gil et al. 2011a, b), indican que es necesario emprender acciones de manejo que reduzcan los niveles de infección de virus en los cultivos de papa de Colombia, siendo ]]>
Agradecimientos
Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia (proyecto 090-2007S4527-87-08). Se agradece a Luz Estela Lagos por su apoyo con la recolección de muestras en el Departamento de Nariño.
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*Correspondencia a: José Fernando Gil. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; josefergil@gmail.com. José Miguel Cotes. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Departamento de Ciencias Agronómicas, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; jmcotes@unal.edu.com. Mauricio Marín. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; mamarinm@unal.edu.com. 1. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; josefergil@gmail.com, mamarinm@unal.edu.com 2. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Departamento de Ciencias Agronómicas, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; jmcotes@unal.edu.com
) se utilizó el mejor predictor lineal insesgado (BLUP, por sus siglas en inglés) para el efecto respectivo, usando la siguiente expresión: