*Dirección para correspondencia

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Abstract

Genetic variability in captive populations of Crocodylus moreletii (Crocodylia: Crocodylidae) using microsatellites markers. Crocodylus moreletii, an extinction threatened species, represents an emblem for tropical ecosystems in Mexico. Surprisingly, there is a lack of information about their genetic constitution, which should be evaluated for a proper management ex situ and for making decisions on the release of crocodiles into natural habitats. The aim of this study was to characterize and compare the genetic variability of four populations of C. moreletii (two wild versus two born ex situ). Through PCR were amplified seven microsatellite polymorphic loci, however a heterozygote deficit, diminished by the presence of null alleles, was found in the populations (average H_O=0.02). The AMOVA indicated that the highest proportion of genetic variability is within populations, and a limited genetic differentiation among populations (average F_ST=0.03), probably due to high inbreeding index (average F_IS=0.97). When comparing the genetic variability between and within other crocodilian species, we found that in C. moreletii is well below those reported. We concluded that the limited genetic variability in ex situ born populations is probably due to a founder effect derived from the social structure of their progenitors, and by the bottleneck effect, inferred by the limited effective population size, that historically
characterizes their natural distribution in wild populations.

Key words: endogamous crocodile, homozygous crocodile, Unit of Management for Conservation of the Wild


Resumen

Crocodylus moreletii representa un emblema para los ecosistemas tropicales de México pero actualmente está amenazada por extinción. Sorprendentemente, hay una falta de información de su constitución genética, que debe ser evaluada para un manejo apropiado ex situ y para toma de decisiones en la liberación de cocodrilos a su hábitat natural. El objetivo del estudio fue caracterizar y comparar la variabilidad genética de cuatro grupos poblacionales de C. moreletii (dos silvestres y dos nacidas ex situ). Mediante PCR se amplificaron siete loci de microsatélites polimórficos, sin embargo se encontró déficit de heterocigotos en las poblaciones (promedio H_O=0.02) mermado por la presencia de alelos nulos. El AMOVA indicó que la mayor proporción de variabilidad genética se encuentra dentro de las poblaciones y una limitada diferenciación genética entre poblaciones (promedio F_ST =0.03), probablemente debida al alto índice de endogamia (promedio F_IS=0.97). Al comparar la variabilidad genética inter e intra especies de cocodrilianos, encontramos que en C. moreletii está muy por debajo de los reportados. Se concluye que la limitada variabilidad genética de las poblaciones nacidas ex situ probablemente se debe al efecto fundador derivado de la estructura social de sus progenitores, y de las poblaciones silvestres, por el efecto cuello de botella, inferido por el limitado tamaño efectivo de población que presentó históricamente en su distribución natural.

Palabras clave: cocodrilos endogámicos, cocodrilos homocigóticos, Unidad de Manejo para la Conservación de la Vida Silvestre, Conservación ex situ, Cocodrilo de Pantano, México.

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Life, ex situ conservation, Morelet’s crocodile, Mexico. Los efectos de las actividades antropogénicas han impactado de manera negativa a la ]]> de la Naturaleza (IUCN 2010). Ante tal situación, se han seguido dos estrategias directas de conservación. Por un lado, su protección se regula ]]> ex situ (Luxmoore 1992). Esta última estrategia es con la finalidad a posteriori de recuperar poblaciones silvestres a través de la liberación de cocodrilos (Huchzermeyer 2003). Una de las prioridades en estos sistemas de crianza es la conservación de la variabilidad genética, ya que es necesario que las crías nacidas ex situ puedan resistir y adaptarse a las presiones ambientales del hábitat en el que son liberadas (FitzSimmons et al. 2002).

Actualmente, se han ]]> Alligator sinensis (Yang et al. 2006) y RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) en A. sinensis (Wu et al. 2002), Caiman latirostris ]]> et al. 2007) y Crocodylus acutus (Porras et al. 2008). Además se han empleado los marcadores de microsatélites (STR: Short Tandem Repeats; Tautz et al. 1986), y se ha determinado que éstos han detectado mejor el polimorfismo en lagartos (Davis et al. 2000), ]]> et al. 2006) y cocodrilos (FitzSimmons et al. 2000).

Las acciones enfocadas a la conservación  mediante el aprovechamiento regulado de los cocodrilianos ex situ se realiza principalmente en sistemas de ]]> moleculares que poblaciones de A. sinensis en cautiverio presentan bajos niveles de variabilidad genética (Wu et al. 2002, Wang et al. 2006), al ]]> et al. 2000, Bishop et al. 2009). En este contexto, la información sobre la variabilidad genética de cocodrilos bajo los diferentes esquemas de aprovechamiento ex situ sería complementaria para tomar decisiones que lleven a liberar individuos genéticamente viables en su hábitat natural (Yang et al. 2006), y de esa forma, recuperar las poblaciones donde históricamente se distribuían e implementar estrategias que preserven la variabilidad genética en las poblaciones en cautiverio (FitzSimmons et al. 2002).

Por muchos ]]> Crocodylus moreletii) distribuidas en las tierras bajas del Caribe Mexicano, fueron diezmadas por la caza ilegal y la pérdida de su hábitat (Álvarez del Toro & Sigler 2001), lo que llevó a catalogarla en amenazada por riesgo de extinción y dependiente de conservación (IUCN 2010). Ante ello, autoridades gubernamentales de México legislaron para su protección especial (DOF 2001), lo que ha favorecido su recuperación ]]> C. moreletii ex situ es mediante esquemas de producción denominados Unidad de Manejo para la Conservación de la Vida Silvestre (UMA) (INE 2000), donde uno de los objetivo es la conservación y liberación de ]]>

En C. moreletii aún no se logrado la liberación de individuos al medio. Hasta ahora, no existen estudios que analicen la variabilidad genética de las poblaciones cautivas en las UMAs establecidas en México, incluyendo la UMA donde se realizó este estudio. Esta información es importante para valorar el acervo genético de los cocodrilos que se pretendan liberar y que debe ser similar al que se encuentra en las poblaciones naturales. Dicha información también se puede utilizar para la planeación de acciones que garanticen mantener y/o incrementar la variabilidad genética de las poblaciones. Por estas razones, el objetivo del presente estudio fue caracterizar y comparar la variabilidad genética de cuatro grupos poblacionales de C. moreletii, dos que fueron extraídos de su hábitat ]]> ex situ, y que se encuentran actualmente bajo las mismas condiciones de cautiverio en una UMA establecida en Veracruz, México.

Materiales y métodos

Características de las poblaciones estudiadas: En la UMA Cacahuatal (INE/CITES/DFYFS-CRIN-0069-SIN/99), que se encuentra ubicada en la localidad José Ingenieros, municipio de La Antigua, Veracruz, México (19°22’19” N - 96°22’19” W), se mantienen reclutadas cuatro poblaciones de C. ]]> de diferente procedencia, cuyos individuos están marcados con placas interdigitales con el número clave de la población de origen. La primera y segunda población están conformadas por individuos capturados en su hábitat silvestre en los municipios de Tezonapa y Gutiérrez Zamora, ambas del estado de Veracruz. La tercera y cuarta población están constituidas por individuos F₁ para explotación comercial, que nacieron y se criaron en UMAs establecidas en el ]]> C. moreletii se asignaron acorde a su origen de nacencia o área ]]>

Material biológico: Del total poblacional manejado en la UMA Cacahuatal (N=800), se eligieron y capturaron a diez ejemplares adultos de cada población (n=40; 5%). A cada uno se le extrajeron aproximadamente 1.5mL de sangre del seno post-craneal (justo por detrás de la cabeza), con un equipo Vacutainer® con EDTA como anticoagulante, siguiendo las ]]> et al. (2008).

Aislamiento y purificación de ADN y amplificación de microsatélites: Antes de aislar el ADN de las muestras sanguíneas, todas se digirieron con proteinasa K a una concentración final de 0.5mg/mL. El ADN de 18 muestras se aisló y purificó con DNeasy Tissue Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. De las restantes 22 muestras, el ADN se aisló a partir de 0.6mL de buffer de extracción CTAB 2% acorde con el protocolo descrito por González & Vovides (2002), y se purificó con columnas de Sephadex.

El ADN de los ejemplares fue ]]> j16, Cj18, Cj20, Cj35, Cj119, Cj128 y Cj131) desarrollados para el género Crocodylus (FitzSimmons et al. ]]> 2 y 0.1% Triton X-100, 1.0mM de cada oligonucleótido, 250μM de cada dNTP, 10-15ng de ADN y 2U de polimerasa Taq (Apex Gene choice). El termociclador (Labnet International Inc.) se programó según los parámetros propuestos para estos loci por Dever & Densmore (2001).
]]>
Electroforesis en gel de acrilamida, visualización y registro de alelos: Los productos de PCR se corrieron en geles de acrilamida al 6%, preparados y teñidos siguiendo el procedimiento descrito por Benbouza et al. (2006). La electroforesis se llevó a cabo por 3h a 1 680V, 60mA y 80W en una cámara vertical para electroforesis (Thermo Scientific Owl P10DS Dual Gel System) con buffer TBE 1X (10mM Trizma, ]]> 2 EDTA). Previo a la electroforesis, el ADN se desnaturalizó 2min a 92ºC. Entre cada diez muestras, se colocó un marcador de peso molecular (ladder) de 100pb (Promega). Después de la electroforesis los geles se tiñeron con nitrato de plata. La imagen del gel se capturó con una cámara Kodak Digital Science®. Para conocer el tamaño de los alelos (en pares de bases; pb), se utilizó el software 1D Image Analysis Software (versión 3.0), tomando como referencia el tamaño de los fragmentos del ]]>

En Excel® se determinó el tamaño mínimo y máximo de los alelos en pb para cada locus. Con el complemento MICROSATELLITE TOOLKIT para Excel® se calculó el contenido de información polimórfica (PIC) por loci. Se usó el software POPGENE (v1.32, Yeh et al. 1999), para calcular el número de alelos observados (na) y ]]> O) y esperada (H_E) y los estadísticos F (F_IS y F_ST) (Nei 1987). Las frecuencias alélicas se obtuvieron con el software FSTAT (v2.9.3, Goudet 2001) y con MICROCHECKER (v2.2.3, Oosterhout et al. 2004) se calcularon las frecuencias de los alelos nulos. Con el software ARLEQUIN (v3.0, Excoffier et al. 2005), se ]]> 1987). Con este mismo software se aplicó la prueba exacta de Fisher para el desequilibrio de ligamiento entre todos los posibles pares de loci (Slatkin & Excoffier 1996), y para confirmar la presencia de alelos nulos, se aplicó la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg. Con este programa también se evaluó la estructura genética ]]> ST con sus respectivas pruebas de significancia (α<0.05), con los cuales se ]]> et al. 1992). Los componentes de variabilidad genética de las poblaciones bajo estudio se determinaron asumiendo equilibro Hardy-Weinberg.

Resultados
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El porcentaje de polimorfismo de los siete loci de microsatélites fue del 100%. Los  valores del PIC fueron superiores a 0.5, lo que indica que son altamente variables, con excepción del locus Cj131 en la población de Gutiérrez Zamora que obtuvo un valor de 0.37 (Cuadro 1). El tamaño mínimo y máximo en pb de alelos se ]]> j128 (80pb) y Cj35 (473pb), respectivamente. La población de Gutiérrez Zamora fue la que presentó el menor (2 alelos en el locus Cj131) y mayor número de alelos (12 alelos en el locus Cj35) (Cuadro 1). Las poblaciones de Villa Juárez, Sin., y Tezonapa, Ver., presentaron el mismo valor promedio de alelos (6.4), que resultó superior a las otras dos poblaciones que tuvieron un promedio de 5.8 alelos ]]> Cuadro 1). En cada grupo poblacional, se obtuvieron valores similares en el número observado de alelos y número efectivo de alelos (Cuadro 1), lo cual indica un posible efecto fundador. Respecto al análisis de la diversidad alélica total, las poblaciones de Villa Juárez, Sin., y Tezonapa, Ver., presentaron un total de 84 y 82 alelos, respectivamente, mientras que las poblaciones de Gutiérrez Zamora, Ver., y Puerto Vallarta, Jal., presentaron una diversidad alélica total de 78 alelos cada una. ]]> j35) y las más altas (locus Cj18) (Fig. 1). Todos los loci presentaron alelos nulos, los cuales tuvieron una frecuencia alta (Fig. 1).    
]]>
La heterocigosis observada (H_O) fue muy baja con respecto a la esperada (H_E),  indicando un déficit de heterocigotos en todas las poblaciones (Cuadro 1). Sólo se detectaron heterocigotos en las poblaciones de Villa Juárez, Sin., y Tezonapa, Ver., en los loci Cj131 y Cj16 ( Cuadro 1). La prueba de desequilibrio de ligamiento genético resultó no significativa para ninguno de los loci (valores de Chi-cuadrado, p=1.000 en la mayoría de los casos). Esta prueba se realizó para determinar si la frecuencia de un locus puede influir en el otro. En este sentido, de las 84 comparaciones para todos los pares de loci (21 comparaciones por pares en cada población), indicaron que la frecuencia entre loci no se encuentran ligadas. Según la prueba de equilibrio de Hardy-Weinberg, todos los valores de H_O fueron ]]> E para todos los loci, lo que confirma la presencia de alelos nulos, resultado que conlleva a obtener altos niveles de endogamia en cada locus, con un valor promedio del F_IS de 0.9, contribuyendo simultáneamente a una reducida diferenciación interpoblacional (F_ST=0.03 promedio) (Cuadro 1).

Los resultados del AMOVA locus por locus indicaron que la mayor variabilidad genética ocurre a nivel intrapoblacional (valores iguales al 100% en la mayoría de los loci). Es decir, la fracción de la variabilidad genética es explicada dentro de cada población y sólo el locus Cj35 detectó que existe un 0.32% de ]]> Cuadro 2). Un dato interesante que arrojó el AMOVA es la obtención de valores negativos para los componentes de varianza y el porcentaje de variabilidad genética entre las poblaciones (exceptuando el locus Cj35), lo que indica la ausencia de una estructuración genética entre las poblaciones (Cuadro 2). Los valores del F_ST ]]> Cuadro 2).

Discusión

]]> Se encontró que las estimaciones del tamaño mínimo-máximo de alelos así como el número de alelos por locus fueron superiores  a lo reportado por Dever & Densmore (2001), Dever et al. (2002), y McVay et al. (2008), para poblaciones de la misma especie en vida silvestre distribuidas en Belice. Estas discrepancias pueden ser debidas al alto polimorfismo que proveen las regiones de ]]> et al. 1991). En este contexto, las evaluaciones de la variabilidad genética en Crocodylus (Fitz- Simmons et al. 2000), han demostrado que el polimorfismo se debe a inserciones/deleciones de nucleótidos en las regiones microsatélites (Tauz 1989, Strassmann et al. 1996), generando altas tasas de mutación y ]]> et al. 1993). La diversidad y las frecuencias alélicas fueron similares a lo reportado para C. rhombifer y C. acutus, posiblemente por la presencia de alelos nulos (Weaver et al. 2008).

En todos los loci, el valor de la ]]> O fue menor a la H_E, lo que indica un marcado déficit de heterocigocidad; de hecho, la mayoría de los valores de la H_O son iguales a cero, lo que pone en manifiesto la inexistencia de heterocigosidad en todas las poblaciones. Esta baja variabilidad genética puede deberse a la presencia de alelos nulos, los cuales se presentan con cierta frecuencia en microsatélites y se ha sugerido que éstos  pudieran mermar los valores de heterocigocidad (Brookfield 1996), por tanto los ]]> et al. 2005). Por un lado, esto pudo surgir basándose en que los individuos de las poblaciones de Puerto Vallarta, Jal., y Villa Juárez, Sin., (que nacieron ex situ y son generación F₁), pueden descender de un solo macho dominante, pero también es probable que durante los eventos reproductivos ocurridos en cautiverio ]]> granjas de C. niloticus, donde los apareamientos entre los individuos reproductivos no es al azar, contribuyendo a disminuir sus niveles de variabilidad genética (Jurgens et al. 1994). En el caso de las poblaciones de procedencia silvestre (Gutiérrez Zamora y Tezonapa, Ver.), que tampoco presentaron variabilidad genética, puede ser reflejo del estado ]]> C. moreletii distribuidas en México (Casas 1995), lo que pudo haber conducido a mantener un limitado tamaño efectivo de población (efecto cuello de botella) o un pequeño grupo de individuos reproductivos (efecto fundador) (Bishop et al. 2009). Esto ]]>

Al comparar los valores de ]]> O=0.02) para las  cuatro poblaciones bajo estudio encontramos que son inferiores a los reportados para otras poblaciones de C. moreletii distribuidas en Belice estudiadas por Dever & Densmore (2001) y Dever et al. (2002) (promedio H_O=0.49 en ambos estudios), lo que pone en manifiesto una reducción en los niveles de variabilidad genética, ]]> medio silvestre. A nivel interespecífico, nuestros resultados son similares a lo reportado para C. niloticus en cautiverio (promedio H_O=0.00) a partir de un estudio de proteínas que muestra la ausencia de variabilidad genética debido al efecto fundador ocurrido en cautiverio (Flint et al. 2000). Es preocupante que las poblaciones de ]]> et al. 1977), como respuesta a los factores ambientales (Adams et al. 1980). En este sentido, las concurrentes presiones al hábitat y los consecuentes impactos sobre la dinámica poblacional de C. moreletii distribuidas en el territorio mexicano, ]]> C. moreletii es una especie sujeta a protección especial en México y amenazada a nivel internacional, por lo que se debe generar un control más estricto para conservar su variabilidad genética. La suma de esfuerzos en la conservación de sus hábitats donde la prioridad sea la conservación de los corredores biológicos para fomentar la migración entre las poblaciones de estos cocodrilos, puede ser una de las acciones para preservar, y en su caso incrementar la ]]>

Tanto los eventos reproductivos ocurridos en cautiverio como los cambios demográficos por el que transcurrieron las poblaciones en vida silvestre reflejan el déficit de heterocigotos, lo cual quiere decir que las poblaciones bajo estudio son endogámicas, consistente con lo ]]> IS, que está influenciado por tener alelos comunes entre los individuos, que generalmente implica que son idénticos por descendencia (Raybould et al. 2002). La endogamia no siempre representa una desventaja para las especies de cocodrilianos, sino que puede considerarse como una adaptación óptima al responder a las presiones del medio (Gartside et al. 1977). Sin ]]> et al. 2010). Esto representa una problemática en la UMA Cacahuatal ya que impacta de manera negativa en los ingresos económicos debido a la obtención de pieles de menor calidad y consecuentemente mantener a los individuos ]]>

El AMOVA indicó que la mayor proporción de la variabilidad genética se presentó dentro de cada población. Por tanto, gran parte de la variación genética fue aportada por la divergencia de los alelos dentro de cada subpoblación y no se detectó una estructuración genética entre las poblaciones. El ]]> C. moreletii fueron extraídas del rango de distribución natural, donde históricamente tenían una distribución más o menos continúa (Álvarez del Toro & Sigler 2001), y posiblemente hubo flujo genético, y los alelos desde entonces, así se han mantenido, y tienden a obtener una baja diferenciación entre poblaciones formando un ]]>

Una de las implicaciones inmediatas para el manejo genético de C. moreletii es continuar realizando estudios de caracterización genética de poblaciones silvestres y de las que se encuentran en las diferentes UMAs, con la finalidad de identificar individuos genéticamente diferentes y ]]> artificial, aunque esta técnica reproductiva aún se encuentra en proceso de desarrolloimplementación- validación para cocodrilos. Dado que los problemas genéticos derivados de endogamia minimizan los procesos básicos de adaptación local de las ]]> O=0.49), o tomar como referencia los niveles de variabilidad genética que se reporten en estudios posteriores con poblaciones de C. moreletii distribuidas ]]> O entre 0.3 a 0.5. Como en la mayoría de las UMAs se obtiene píe de cría extraídas de poblaciones silvestres, se puede sugerir que previo a la formación de sus núcleos reproductivos se realicen estudios siguiendo los métodos utilizados en este trabajo y solo considerar aquellos individuos genéticamente diferentes para la reproducción, lo que podría  llevar a la disminución de la homocigosis en sus descendientes. Estudios futuros deben proporcionar información sobre el tamaño ]]> C. moreletii en cautiverio con la finalidad de prevenir el detrimento genético por endogamia. Esto podría preservar la variabilidad genética de los cocodrilos durante ciertos periodos de tiempo generacional y así tener bases más sólidas para generar un plan de liberación de cocodrilos a su hábitat para garantizar su ]]>

Se puede concluir que la limitada variabilidad genética de las poblaciones de C. moreletii que nacieron en las UMAs (Villa Juárez, Sin. y Puerto Vallarta, Jal.), se debió a un inadecuado manejo reproductivo en estos sistemas de crianza, permitiendo el apareamiento de un limitado grupo ]]> demográfica que, históricamente han tenido las poblaciones. A nivel inter e intraespecífico, los parámetros de variabilidad genética fueron menores a los reportados para la misma especie y ]]> C. moreletii en su distribución natural y la fijación de alelos se ]]> Finalmente, el número de loci analizados reflejó el estado actual de la variabilidad genética del grupo poblacional en estudio; por tanto se puede ampliar el análisis aumentando el número de individuos caracterizados junto con la inclusión de otras poblaciones, a fin de llegar a conclusiones más precisas para generar un plan de recuperación de las poblaciones de C. moreletii en las localidades donde fueron extintas.

Agradecimientos

A la Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT) por brindar el permiso especial de colecta SGPA/ DGVS/07875. A la UMA Cacahuatal por los apoyos brindados ]]> Sistemática Molecular del Instituto de Ecología, A. C. por sus respectivos financiamientos.

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Referencias

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*Correspondencia:
Ricardo Serna-Lagunes: Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados, km. 88.5 Carretera Federal Xalapa-Veracruz, Tepetates, Municipio de Manlio F. Altamirano, C.P. 91700, Apartado Postal 421, Veracruz, México; rserna@colpos.mx
Dolores González: Laboratorio de Sistemática Molecular. Instituto de Ecología, A.C., Carretera antigua a Coatepec N.º 351, El Haya, Xalapa, C.P. 91070, Apartado Postal 63, Veracruz, México; dolores.gonzalez@inecol.edu.mx
Pablo Díaz-Rivera: Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados, km. 88.5 Carretera Federal Xalapa-Veracruz, Tepetates, Municipio de Manlio F. Altamirano, C.P. 91700, Apartado Postal 421, Veracruz, México; pablod@colpos.mx

1. Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados, km. 88.5 Carretera Federal Xalapa-Veracruz, Tepetates, Municipio de Manlio F. Altamirano, C.P. 91700, Apartado Postal 421, Veracruz, México; rserna@colpos.mx, pablod@colpos.mx
2. Laboratorio de Sistemática Molecular. Instituto de Ecología, A.C., Carretera antigua a Coatepec N.º 351, El Haya, Xalapa, C.P. 91070, Apartado Postal 63, Veracruz, México; dolores.gonzalez@inecol.edu.mx

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