Miguel Guevara^1,2, Leandro Bastardo², Roraysi Cortez², Bertha Arredondo-Vega³, Lolymar Romero⁴ & Patricia Gómez¹

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Abstract

Rhodomonas salina (Cryptophyta) pastes as feed for Brachionus plicatilis (Rotifera). Rotifers are an important live feed for first feeding larvae of many fish species. The use of concentrated algae cells in the mass culture of the rotifer Brachionus plicatilis (Brachionidae) has opened new horizons for research on this organism. Pastes of Rhodomonas salina (Pyrenomonadaceae) obtained either by centrifugation or flocculation with chitosan were preserved, with or without vitamin C, at -20°C for four weeks and were evaluated biochemically (proteins, lipids, pigments and fatty acids contents) and subsequently, were used to feed the rotifer Brachionus plicatilis at a ratio of 25mg/L/day. Four different microalgae pastes were prepared: (1) centrifuged and preserved with vitamin C (CV), (2) centrifuged and preserved without vitamin C (C), (3) flocculated and with vitamin C (FV) and (4) flocculated without vitamin C (F). All treatments showed similar contents of proteins and total lipids with respect to control culture (a fresh culture of R. salina), with mean values of 40.0±2.32% and 12.0±1.45%, respectively. The pheophytin a/chlorophyll a ratio, a general indicator of the chemical status of microalgal concentrates, was similar (0.09-0.11) between centrifuged pastes and control culture, but was found to be higher in flocculated pastes (1.28-1.48). The fatty acid profile varied with respect to the control culture, mainly in the proportion of the essential polyunsaturated fatty acids (PUFAs): eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). Total PUFAs, EPA and DHA contents were statistically similar between centrifuged pastes and control culture (PUFAs: 47%, EPA: 4% and DHA: 4.7%), whereas values obtained for flocculated pastes were significantly lower. The rotifers grew equally well when fed with centrifuged pastes or control culture (maximum density: 320rotifers/mL; instantaneous growth rate: 0.23rotifers/day, fecundity: 1.49eggs/female and productivity: 43x103rotifers/L/day. No significant effect of vitamin C was found when used as a paste preservative. We concluded that centrifugation is an effective harvesting method, and that freezing to -20ºC for four weeks (no vitamin added), may help maintain the nutritional quality of R. salina paste, similar to fresh microalgae and can be offered to Brachionus plicatilis. Rev. Biol. Trop. 59 (4): 1503-1515. Epub 2011 December 01.

Pastas de Rhodomonas salina, obtenidas mediante centrifugación y floculación con quitosano y preservadas con o sin vitamina C, a -20°C fueron evaluadas bioquímicamente y proporcionadas como alimento al rotífero Brachionus plicatilis. Las pastas microalgales: (1) centrifugada y con vitamina C (CV), (2) centrifugada y sin vitamina C (C), (3) floculada y con vitamina C (FV) y (4) floculada y sin adición de vitamina C (F); mantuvieron sus contenidos de proteínas y lípidos totales similares al cultivo control, con valores de 40.0±2.32% y 12.0±1.45%, respectivamente. La relación feofitina a/clorofila a fue similar (0.09-0.11) entre las pastas centrifugadas y el cultivo control, pero mayor en las pastas floculadas (1.28-1.48). Las pastas centrifugadas presentaron porcentajes de PUFAs totales, EPA y DHA similares al cultivo control (PUFAs: 47%, EPA: 4% y DHA: 4.7%) y superiores al de las pastas floculadas. Las pastas obtenidas por centrifugación indujeron un crecimiento del rotífero igual al obtenido con el alimento control (densidad máxima: 320rotíferos/mL; tasa instantánea de crecimiento: 0.23rotíferos/día, fecundidad: 1.49huevos/ hembra y productividad: 43x103rotíferos/L/día). Se concluye que la pasta de R. salina centrifugada y congelada a -20°C, durante cuatro semanas, sin adición de vitamina C, mantiene su calidad nutricional similar a la del alga fresca y puede ser usada como alimento de Brachionus plicatilis.

Palabras clave: pasta de microalgas, acuicultura, Rhodomonas salina, floculación, rotíferos.

La producción de microalgas en las salas de cría tiene como objetivo proveer de alimento vivo, de excelente calidad nutricional, a especies animales en cultivo, especialmente larvas y juveniles de moluscos bivalvos y camarones peneidos (Brown & Robert 2002). Esta actividad presenta un elevado costo de producción, el cual puede variar entre 50 y 200$/ kg de biomasa seca de microalga, lo que puede representar entre el 20 y el 50% de los costos de operación de una sala de cría (Borowitzka 1997). Una alternativa a este problema es el uso de biomasa microalgal preservada en forma de pastas, ya que ésta podría reducir los costos de producción y, además, disminuir la dependencia del alimento vivo en los periodos donde las variaciones estacionales limitan su producción (Heasman et al. 2000).

Las criptófitas han sido poco utilizadas para producir concentrados algales, a pesar de su excelente calidad nutricional y facilidad de cultivo (Renaud et al. 2002, Bermúdez et al. 2004). Rhodomonas salina (Wislouch) Hill & Wetherbee (1989) es la criptófita que más se ha utilizado en acuicultura debido, principalmente, a su alto contenido de proteínas, lípidos y ácidos grasos poliinsaturados (Fernández et al. 1989, Zhukova & Aizdaicher 1995, Dunstan et al. 2005). Su valor nutricional explica su capacidad para incrementar la tasa de supervivencia del pectínido Pecten maximus (Tremblay et al. 2007) y la tasa de crecimiento instantánea de juveniles de Crassostrea gigas (MCCausland et al. 1999). Por eso uno de los objetivos de este estudio fue evaluar la composición bioquímica de pastas obtenidas a partir de una cepa de Rhodomonas salina, mediante el uso de distintos métodos de cosecha y preservación del concentrado microalgal.

Cepa de microalga y del rotífero: La cepa CS174 de Rhodomonas salina (Wislouch) Hill & Wetherbee (1989) fue obtenida del Cepario CSIRO Algal Culture Collection, CSIRO Division of Marine Research, Hobart, Tasmania. La cepa de Brachionus plicatilis fue aislada de las salinas de Araya, Venezuela (10º30’-10º40’’ N - 63º32’-64º21’’ W). Ambos organismos están depositados en la colección de cultivos planctónicos del Laboratorio de Acuicultura, extensión Plancton del Departamento de Biología Pesquera, del Instituto Oceanográfico de Venezuela, Universidad de Oriente.

Condiciones del cultivo de la microalga: Un cultivo de R. salina en fase de crecimiento exponencial, aclimatado durante tres generaciones (K=0.9div/día) a luz continua (100μmol/m2/s de irradianza), 29±1ΊC y pH entre 7.5-8.5 se usó para inocular 13L de medio fresco contenidos en botellones de vidrio de 15L, provistos de aireación constante (200mL/ min). Estos nuevos cultivos se realizaron por cuadruplicado con una densidad inicial de 1x105cel/mL, en medio f/2 (Guillard 1975) con una concentración de nitrato y fosfato de 3.5mM y 0.018mM, respectivamente, utilizando agua de mar (37UPS) filtrada y esterilizada en autoclave (15psi/120°C/15 min).

Producción de pastas algales de Rhodomonas salina: Cuando los cultivos alcanzaron la fase de crecimiento exponencial tardía (6to día), se procedió a realizar la cosecha total, para lo cual se evaluaron dos métodos: (a).-Centrifugación: consistió en centrifugar 6L de cultivo, de cada réplica, a 3 000rpm/5min, usando tubos cónicos de 15mL de capacidad. (b).- Floculación: se basó en agregar al cultivo (6L de cada réplica) una solución de quitosano en ácido acético (7.5g de quitosano/500mL de ácido acético al 20%), al cual se le subió previamente el pH hasta 10 con NaOH 1mol/L. La adición de la solución de quitosano fue hasta que el pH se estabilizó entre 7 y 8. A continuación se agitó y dejó en reposo para propiciar la floculación (Morales et al. 1985).

Las pastas algales (obtenidas por centrifugación y floculación) fueron divididas en dos partes cada una y a una de las partes se le agregó 0.1% m/m de vitamina C (ácido ascórbico) con la finalidad de evaluar su utilidad como antioxidante (Nunes et al. 2009). Posteriormente, todas las pastas fueron almacenadas durante cuatro semanas a -20ºC en oscuridad. De esta forma, quedaron constituidas cuatro tipos de pastas algales: (1) centrifugada y con vitamina C (CV), (2) centrifugada y sin vitamina C (C), (3) floculada y con vitamina C (FV) y (4) floculada y sin adición de vitamina C (F).

Diariamente, se determinó la densidad de rotíferos. Cuando los cultivos mostraron sus mayores valores de densidad poblacional se procedió a calcular la tasa instantánea de crecimiento, la fecundidad (número de huevos/hembra) y productividad (rotíferos/L/día) según Navarro & Yúfera (1998).

Los resultados de las evaluaciones bioquímicas de las pastas microalgales, así como los datos de crecimiento, productividad y fecundidad de los rotíferos se compararon mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía, utilizando el programa estadístico Statistix V.1.0, previo cumplimiento de los supuestos de: normalidad del error (prueba de Wilk-Sahpiro), homogeneidad de las varianzas (prueba de Bartlett) y aditividad de los efectos (prueba de Tukey). Los datos que mostraron diferencias significativas (p<0.05) se les aplicó la prueba de Dunnet, con el fin de establecer diferencias grupales, siguiendo las recomendaciones de Zar (1984).

Contenido de proteínas y lípidos totales: Los contenidos de proteínas y lípidos totales de las diferentes pastas (% con base a masa seca) no mostraron diferencias significativas (Dunnet, p>0.05) ni entre ellas ni con respecto al cultivo fresco (Fig. 1). Los valores promedio (media±desviación estándar) para estos parámetros fueron 40.0±2.3% de proteínas y 12.0±1.4% de lípidos.

Perfil de ácidos grasos: El perfil de ácidos grasos de las cuatro pastas de R. salina (FV, F, CV y C), almacenadas durante cuatro semanas a -20°C presentó pocas variaciones con respecto al control (cultivo fresco) (Cuadro 1). Las mayores variaciones se observaron en el contenido total de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), los cuales mostraron diferencias significativas entre las diferentes pastas (Dunnet, p<0.05).

Relación feofitina a/clorofila a: La relación feofitina a/clorofila a mostró diferencias significativas entre las pastas centrifugadas y floculadas (Dunnet, p<0.05). Como se observa en la Fig. 2 la relación feofitina a/clorofila a de las pastas obtenidas por centrifugación varió entre 0.09 y 0.11; valores muy bajos y similares al obtenido para el cultivo control (Dunnet, p>0.05). Por el contrario, las pastas obtenidas por floculación con quitosano presentaron valores mucho más elevados (1.25 a 1.45), sin diferencias significativas entre ellos (Dunnet, p>0.05), lo que muestra que la adición de vitamina C a las pastas no evitó la degradación de la clorofila a durante el tiempo de almacenamiento.

Este estudio demuestra la factibilidad de usar pastas de Rhodomonas salina como alimento para B. plicatilis, un rotífero ampliamente utilizado en acuicultura como vehículo marinas en cultivo (Lubzens et al. 2001). La centrifugación o floculación no afectó la composición de proteínas y lípidos de las pastas, así como tampoco las afectó el almacenamiento a -20ºC por 4 semanas.

Por otro lado, las pastas obtenidas por centrifugación conservaron la proporción de PUFAs esenciales, EPA y DHA similares al cultivo fresco y produjeron mayor crecimiento y fecundidad de B. plicatilis, que las pastas obtenidas por floculación con quitosano (Cuadro 1, 2, Fig. 3). Este último hallazgo respalda un hecho que ha sido previamente destacado para numerosas especies (Levine & Sulkin 1984, Pernet & Tremblay 2004): la importancia de los PUFAs como nutrientes esenciales, y convierte la diferencia del método de concentración de microalgas en un hecho muy relevante.

Además, las pastas obtenidas por centrifugación mostraron una mayor estabilidad bioquímica que las obtenidas por floculación, tal como se evidencia en sus perfiles de ácidos grasos (Cuadro 1) y en su baja relación feofitina a/clorofila a (Fig. 2). Este comportamiento se debería a que las células sufren menor daño físico al ser centrifugadas, resultado que se respalda en las investigaciones de Beneman et al. (1980), Montaini et al. (1995), Albentosa et al. (1997), D`Souza et al. (2000), Heasman et al. (2000), Molina-Grima et al. (2003) y Nunes et al. (2009), quienes coinciden en las ventajas comparativas de este método de cosecha.

Algunos autores han indicado que la estabilidad bioquímica, así como la viabilidad celular de las pastas de microalgas puede mejorarse a través del uso de aditivos, tipo antioxidantes. Heasman et al. (2000) señalaron que las pastas de Skeletonema con adición de vitamina C como antioxidante, mantienen una calidad nutricional superior a aquellas que carecen de este aditivo; sin embargo, en nuestro estudio las pastas que contenían vitamina C no mostraron diferencias significativas, en cuanto a su composición bioquímica, con respecto a las que no contenían este aditivo. Resultados similares fueron obtenidos por Robert et al. (2001), quienes encontraron que las pastas de Tetraselmis suecica, obtenidas por centrifugación y almacenadas sin vitamina C, a 4°C, durante cinco semanas, mantuvieron estable su perfil de ácidos grasos y su contenido de lípidos y proteínas. De igual forma, Ponis et al. (2003b) demostraron que pastas de Pavlova lutheri preservadas a 1 y 4°C, sin vitamina C, mantienen inalterable su valor nutricional durante 27 días. Esta concordancia de resultados permite concluir que la baja temperatura sería suficiente para mantener la calidad nutricional de los concentrados de microalgas, no siendo necesaria la adición de preservantes en muchos casos.

La estabilidad del perfil de ácidos grasos obtenida en esta investigación en las pastas de nutrientes en la alimentación de especies centrifugadas de Rhodomonas salina, luego del proceso de almacenamiento, ha sido previamente observada en otras especies de microalgas como Tetraselmis suecica e Isochrysis galbana, cuyas pastas han mantenido estable su perfil de ácidos grasos cuando se preservan a bajas temperaturas (Molina-Grima et al. 1994, Montaini et al. 1995).

A pesar de que en esta investigación no se analizó la composición bioquímica del rotífero B. plicatilis, se puede inferir que éstos debieran presentar una composición bioquímica adecuada, dado que muchos estudios han demostrado que la calidad nutricional de este organismo depende de la composición bioquímica de la microalga utilizada para su alimentación (Lubzens et al. 1995, Dhert et al. 2001). Recientemente, Seychelles et al. (2009) evidenciaron que el perfil de los ácidos grasos de los rotíferos fue similar al de las microalgas usadas para su alimentación (microalgas frescas o en forma de pasta).

Las pastas centrifugadas de R. salina caracterizadas en este estudio, también podrían utilizarse, directamente, como alimento de larvas y juveniles de moluscos bivalvos, debido a su composición bioquímica, específicamente su perfil de ácidos grasos. Numerosos estudios han demostrado que las microalgas con altos contenidos de EPA y DHA favorecen el crecimiento de juveniles de Ostrea edulis (Enright et al. 1986) y larvas de Patinopecten yessoensis (Whyte et al. 1989). De igual forma, Nell & O’Connor (1991) encontraron que las pastas de Pavlova lutheri y Chaetoceros calcitrans refrigeradas a 4ºC por una o dos semanas produjeron mayor crecimiento larvario de la ostra Saccostrea commercialis que el obtenido con las microalgas frescas. McCausland et al. (1999) lograron incrementar hasta en un 87% el crecimiento de juveniles de Crassostrea gigas al alimentarlas con pasta de Skeletonema costatum, cosechada mediante centrifugación y almacenada a 4ºC. Cabe destacar que el DHA es, en general, un ácido graso escaso en las microalgas, por lo que su contenido relativamente alto en R. salina (Cuadro 1) la destaca como una especie de especial valor nutricional para la acuicultura.

Además de las ventajas ya mencionadas de utilizar pastas de microalgas como alimento en acuicultura, se ha planteado que su uso podría ser incluso más beneficioso para la salud de los animales que el uso de caldos de microalgas, ya que el medio de cultivo de las microalgas puede contener toxinas y abundantes bacterias, las que pueden inhibir el crecimiento de diferentes organismos animales en cultivo (DeMott et al. 1991, Kiviranta et al. 1991, O´Connor et al. 1992, Lee & Shen 2004, Sun et al. 2008).

Finalmente, se concluye que la centrifugación, como método de cosecha, y la congelación a -20ºC, durante cuatro semanas, sin adición de vitamina C, permiten mantener la calidad nutricional de la pasta de R. salina similar a la del alga fresca y puede ser utilizada como alimento para Brachionus plicatilis

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