Caracterización fenotípica y genotípica de doce rizobios aislados de diversas regiones geográficas de Venezuela
María Eugenia Marquina, Néstor Enrique González & Yulimar Castro
Laboratorio de Fijación Biológica de Nitrógeno y Cultivos de Tejidos Vegetales in vitro, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes. Núcleo Pedro Rincón Gutiérrez, Edificio A, 2º piso, La Hechicera, Mérida, Venezuela; martu@ula.ve, ngonzalezv2007@gmail.com, yulica@gmail.com Dirección para correspondencia
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Abstract
Phenotypic and genotypic characterization of twelve rhizobial isolates from different regions of Venezuela. Rhizobial taxonomy and systematics have progressed ]]>
Rasgos fenotípicos y marcadores moleculares de ADN se utilizaron para investigar la ]]>
Rhizobium tropici CiAT 899 y Sinorhizobium americanum CFN-Ei156, mientras que el grupo B está estrechamente vinculado a Bradyrhizobium ]]>
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Palabras clave:Rhizobium, Bradyrhizobium, caracterización fenotípica, PCR-RFLP, ADNr 16S.
Las bacterias denominadas comúnmente rizobios presentan varias formas de vida; pueden comportarse como saprófitos en el suelo establecer una asociación simbiótica y formar nódulos con las raíces y tallos de las leguminosas, donde tiene lugar la reducción del nitrógeno atmosférico en amonio, el cual es transportado a la planta y convertido en biomoléculas esenciales, o bien estar presentes como endófito en raíces de diferentes especies ]]>
et al. 2001).
La taxonomía rizobiana basada tanto en técnicas moleculares como en las aproximaciones polifásicas ha permitido reconocer seis géneros hasta la actualidad, los cuales son: Allorhizobium, Mesorhizobium, ]]>
y Rhizobium (Wang et al. 2001), los mismos constituyen un grupo filogenéticamente heterogéneo en el que la taxonomía es continuamente reexaminada, como en el caso del género Sinorhizobium, cuyo nombre fue cambiado por la denominación más antigua Ensifer (Young 2003) y los géneros Allorhizobium ]]>
Agrobacterium, que han sido incluidos dentro del género Rhizobium (Young 2001).
La taxonomía y sistemática rizobiana ha progresado notablemente por el análisis comparativo del ADNr 16S (Young 2001) y las ]]>
et al. 2001).
El ADN ribosómico 16S ]]>
et al. 1994). Los mismos autores han demostrado que la combinación de cuatro enzimas (Cfo, HinfI, MspI y NdeII), tienen el mismo poder discriminativo ]]>
Rhizobium en especies.
Los estudios de diversidad rizobial, particularmente en Venezuela, son escasos; entre ellos se puede señalar un trabajo realizado con aislados autóctonos de Bradyrhizobium sp., obtenidos de Lupinus ]]>
et al. (1998) estudiaron la diversidad de rizobios nativos aislados de especies autóctonas de Sesbania en diferentes zonas de Venezuela, los cuales analizan características fenotípicas y genéticas. En ]]>
senta una caracterización fenotípica, un análisis por PCR- RFLP y un perfil plasmídico de aislados rizobianos de diversas regiones de Venezuela, como un aporte al conocimiento de la diversidad rizobial del país.
Materiales y métodos
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Aislados, cepas bacterianas de referencia y medios de cultivo: La ubicación geográfica de las regiones donde se tomaron las muestras de suelo o nódulos para capturar y/o aislar los rizobios se muestran en la Fig. 1. Todos los aislados y cepas de referencia (Cuadro 1, 2) han ]]>
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Todos los ensayos se realizaron por triplicado con cultivos de 108cel/mL, incubados a 30°C, ]]>
Prueba de infectividad: La autenticación de los aislados se realizó en Macroptilium ]]>
(Siratro) (Bromfield & Barran 1990) y Crotalaria sp. Previamente se escarificaron las semillas con papel lija Nº 280, y se esterilizó con hipoclorito 0.5% durante 7min; se germinaron a 26ºC en medio TY agarizado (Beringer 1974) y se sembraron en recipientes plásticos (7 x 15cm) con arena estéril, impregnada inicialmente con solución Hoagland (Taiz & Zeiger 1998) con el nitrógeno diluido a la mitad (nitrógeno de arranque). El ensayo contaba con 5 ]]>
Caracterización ]]>
Primero se determinó las características morfológicas de las colonias rizobianas (Cuadro 3) (CIAT 1988), el crecimiento en el medio Luria Bertani (LB) y la producción de ácido o base, de las cepas de referencia y aislados rizobianos (Vincent 1975, Rodríguez-Mendoza 1993). Para probar la tolerancia a varias temperaturas (20º, 27º, 30º, 35º y 40ºC) y a medios salinos con NaCl al 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5% (Wang et al. ]]>
La capacidad para tolerar pH ácidos se efectúo según Ayanaba et al. (1983) con modificaciones. Para ello se prepararon cajas de Petri con el medio de Keyser & Munns (1979) modificado, a pH 4.0, 4.4, 4.6, 5.0, 5.2, 5.6, 6.0 y 6.8. También se comprobó la resistencia intrínseca a antibióticos, los cuales fueron ]]>
µg/ mL): gentamicina (Gmc.) 2.5, 5, 25, 50 y 100. Lincomicina (Lmc.), cloranfenicol (Cam.) 50, 100, 200, 300. Amikacina (Amkc.), ampicilina (Amp.), doxiciclina (Doxi.), ácido nalidíxico (Nal.) y tetraciclina (Tc.) 5, 25, 50, 100 y 200, kanamicina (Kan.) 5, 10, 25, 50, 8 y estreptomicina (Str.) 5, 10, 25, 50, 100 y 200 (Wang et al. ]]>
Para el ensayo de crecimiento en diferentes fuentes carbonadas y nitrogenadas, se cultivaron las bacterias en 5mL de medio YMmrc, en agitación continua (200rpm), durante 2-5días. Después se efectúo el lavado de las células con NaCl 0.8% y se permitió el crecimiento en medio basal salino M9 (Millar 1972) con biotina, sin fuentes carbonadas y nitrogenadas (carenciamiento) durante 24h. ]]>
et al. 1998). También se ensayaron 14 fuentes nitrogenadas esterilizadas por filtración: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-fenilalanina, L- glicina, L-histidina, L-homoserina, L-leucina, L-metionina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina y urea (todas a una concentración 0.5g /L) (Wang et al. 1998). Los cultivos bacterianos se incubaron a la misma temperatura que los ensayos anteriores. En todos los ensayos el crecimiento fue ]]>
Caracterización genotípica de rizobios
Perfil ]]>
Se empleó una modificación del método de lisis alcalina para aislar plásmidos de alto peso molecular (Casse et al. 1979), para ello se utilizó cultivos frescos crecidos en agitación (200 rpm) durante 1-3 días en 10mL de medio YMLm.
La presencia de ]]>
coli K-12, portadoras de cinco plásmidos de referencia provenientes del Centro Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) 1- CVCM 134, (pR478, 279 Kb); 2- CVCM 132 (pR27, 188 Kb); 3- CVCM 153 (pR1, 104 Kb), 4- CVCM 164 (pR64, 121 Kb), 5-CVCM 194 (pRP4, 60 Kb).
Extracción y purificación del ADN cromosómico: En el procedimiento de extracción y purificación del ADN, se utilizó el Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) ®, lavando previamente las células con NaCl 0.8%. ]]>
Amplificación del ADNr 16S, mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): La reacción de amplificación fue llevada a cabo con los oligonucleótidos cebadores fD1 y rD1 descritos por Weisburg et al. (1991).
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La reacción de PCR se realizó de acuerdo a Laguerre et al. (1994) con modificaciones en un volumen de 50µL, donde se emplearon entre 50 y 100ng de ADN genómico y 1.25 U de Taq Polimerasa (Promega)®. La amplificación fue realizada en un termociclador Gene Cycler marca BiO-RAD modelo 170-6700-170-6701. Los amplificados ]]>
µL) fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa de uso rutinario para PCR, al 0.9% (12cm x 20cm) en tampón TBE 1X pH 8.0, bajo las siguientes condiciones: 100 Voltios, 80mA, durante 4h.
Ensayos de restricción ]]>
Alícuotas de 8-12µL de amplificados fueron digeridos con 5 U de endonucleasas de restricción (Promega) ® en un volumen de reacción de 20µL a 37ºC durante 4h. Además se utilizaron las siguientes enzimas de restricción: Mspi, Rsai, Sau 3AI, y HhaI, éstas dos últimas corresponden a endonucleasas, y a los isoesquizómeros de las enzimas CfoI y NdeII.
Los digeridos (10μL c/u) fueron analizados en geles de poliacrilamida (8%), de grosor 0.75mm, en un sistema de electroforesis vertical, Mini-Protean II cell (Bio Rad), durante 2h aproximadamente. Luego se empleó un tampón TBE 1X pH 8.0 a 19mA, 72 V. Los geles fueron teñidos por el método de tinción con nitrato de plata (Bassam et al. 1991).
Las características fenotípicas y los patrones de restricción del ADNr 16S de los rizobios fueron codificados en forma binaria (1, presencia de la característica o de la banda; 0 ausencia de las mismas) y analizados por Taxonomía Numérica, empleando el programa estadístico SPSS, versión 13 para construir las matrices de similaridad de enlace simple y luego obtener ]]>
sm) representado en los dendrogramas, los cuales fueron elaborados mediante el algoritmo Unweighted Pair-Group Method using Aritmethic Averages (UPGMA) (Programa Statistica, versión 6.0).
Resultados ]]>
Prueba de infectividad: La presencia de nódulos de color marrón rojizo, permitió considerar a todos los aislados rizobianos como efectivos y eficientes.
Macroptilium ]]>
s (Siratro), considerada una especie promiscua (Bromfiel & Barran 1990) no fue nodulada por el rizobio ME 01 pero sí formó nódulos eficientes en Crotalaria sp. y en Phaseolus vulgaris L. (datos no publicados).
Caracterización fenotípica
Características morfológicas de las colonias de rizobios autóctonos y tiempo de aparición de las colonias: Las colonias de los aislados rizobianos estudiados presentaron morfologías muy diversas y tiempos de aparición diferentes. Los microsimbiontes NB 1.1, NB 2.1, NB 4.1, NB 9.1, y NB 15.1, originaron colonias de crecimiento lento y extralento (tiempo de aparición de las ]]>
Cuadro 3). El aislado Trébol, a pesar de presentar crecimiento extralento se diferenció de los anteriores por formar colonias de aspecto translúcido y brillante de consistencia mucilaginosa, y el aislado NB 23.1 con morfología similar al primer grupo, presentó crecimiento rápido (colonias apreciables a los 3-4 días) (Cuadro 3). ]]>
El aislado de Phaseolus vulgaris L., Nod 2Rojo (Nod 2R), de crecimiento lento, originó colonias muy similares a Bradyrhizobium elkanii y B. japonicum, lo que contrasta con las del simbionte ME 01, aislado también de nódulos de la misma especie vegetal, pero con características similares a
R. tropici CIAT 899 (Cuadros 3, 4). Las colonias de Rm Vivero (RmV) y Rm Borbollón (RmB), aislados de alfalfa, se diferenciaron por el color blanco crema y blanco lechoso respectivamente y se constató que ambas son de crecimiento rápido. El aislamiento proveniente de Leucaena sp. [Leu 2A (1)2], también presentó crecimiento rápido, pero difería de las anteriores, en cuanto a la ]]>
La caracterización fenotípica de 12 aislados rizobianos, provenientes de diversas regiones geográficas de Venezuela, mostró una población heterogénea y se catalogó cuatro categorías en relación al tiempo en que se apreció el crecimiento de las colonias, de acuerdo al criterio ]]>
Rizobios de crecimiento rápido (colonia apreciable en 3-4 días). En este grupo se incluyó los aislados NB 23.1, Leu 2A (1)2, Rm V, Rm B, de condición semejante a la cepas, Sinorhizobium meliloti 41 y ]]>
Rhizobium etli CFN42 (Cuadros 3, 4).
Rizobios de crecimiento muy rápido (colonia apreciable en 1-2 días), donde se incluyó la cepa ME 01, muy similar a las cepas de referencia R. tropici CIAT 899,
S. americanum CFNEi 156 y A. tumefaciens C58 (Cuadros 3, 4).
Rizobios de crecimiento lento (colonia apreciable en 5-6 días), señalando los aislamientos, Nod 2R, NB 15.1 y ]]>
sp. CIAT 2453.
Rizobios de crecimiento extralento (colonia apreciable en 7-9 días), agrupó los aislados NB 1.1, NB 2.1, NB 4.1, NB 9.1 y Trébol, similares a las cepas de referencia B. elkanii USDA 76 y B. canariense BTA-1 y B. ]]>
DSMZ 30131 (Cuadros 3, 4).
Características bioquímicas: El 41.6% de los aislados produjeron reacción ácida (ME 01, Trébol, Rm V, Rm B y NB 23.1), todos de crecimiento rápido-más rápido, con ]]>
Cuadro 5).
En relación al crecimiento ]]>
Cuadro 5).
Todos los aislados analizados ]]>
Los ácidos ]]>
Todos los aislados metabolizaron la L-asparagina; mientras que los aminoácidos L-valina y L-fenilalanina fueron los sustratos de menor preferencia como ]]>
El dendrograma A de la Fig. 2 elaborado con base a 40 atributos, relacionados a la utilización de fuentes de carbono, nitrógeno, la producción de ácido o álcali y crecimiento en medio LB, permitió ]]>
El Grupo I incluyó una mezcla heterogénea de siete aislados autóctonos y siete cepas de referencia, pertenecientes a diversos géneros (Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium), los cuales se caracterizaron por utilizar L(+) arabinosa a excepción de NB ]]>
Dentro del Grupo I se separaron los siguientes subgrupos: el subgrupo Ia (ME 01) que metabolizó D(+)lactosa y L-fenilalanina y está relacionado con un ]]>
sm=0.1 (90% similaridad) a Bradyrhizobium sp. CIAT 2453, R. etli CFN42 y R. tropici CIAT 899. El subgrupo Ib (Nod 2 R, NB 1.1, NB 4.1 y NB 23.1) que no utilizaron estos compuestos con excepción del aislamiento NB 4.1 que creció en presencia del carbohidrato. El subgrupo Ic (S. meliloti 41) fue incapaz de utilizar el α-cetoglutarato. El subgrupo Id (NB 15.1) no ]]>
El Grupo II incluyó a Rm V y Trébol que emplearon el 67.5% de la totalidad de fuentes suministradas. Este último con 85% de similaridad (Dsm=0.15) a A
grobacterium tumefaciens C58 y Rm B utilizó el 77.5% con 87% de similaridad a Sinorhizobium americanum CFN-EI 156 (Dsm=0.13). Los Grupos III y IV, conformados por NB 9.1 y Leu 2A (1)2 respectivamente, presentaron un estrecho rango de auxotrofía. El primero de ellos metabolizó el 65% de los sustratos y apenas el 52.5% de los compuestos carbonados y nitrogenados fue aprovechado por Leu 2A(1)2, y se ]]>
Todos los aislados fueron resistentes a altos niveles de lincomicina (300µg/mL), gentamicina (2.5-100 µg/mL) y ácido nalidíxico (5-100µg/mL). La ]]>
las cepas estudiadas.
El dendrograma B de la Fig. 2 separó cuatro grupos con base en la resistencia intrínseca a 10 antibióticos. El Grupo I conformado por ]]>
R. tropici CIAT 899, las cuales presentaron un bajo Dsm=0.12 correspondiente a 88% de similaridad en relación a la resistencia (μg/mL) a los siguientes antibióticos: gentamicina (25), lincomicina (300), ampicilina (50), amikacina (5), estreptomicina (200), cloranfenicol (100) y ácido nalidíxico (100). El subgrupo Ib (Rm V y Rm B) se separó del grupo anterior con un Dsm 0.24 (76% de similaridad) y junto a
S. meliloti 41 y S. americanum CFN-Ei156 mostraron en común resistencias a gentamicina (5μg/mL), ampicilina, kanamicina (25), ácido nalidíxico (100), estreptomicina (200), lincomicina, cloranfenicol (300). Todas fueron susceptibles a doxiciclina. El subgrupo Ic lo integró R. etli CFN42 resultando susceptible a doxiciclina, ampicilina, cloranfenicol y tetraciclina. ]]>
El grupo II (Fig. 2B) lo integraron la mayoría de los aislados autóctonos: Nod 2R, NB 2.1, NB 4.1, NB 9.1, NB 15.1, NB 23.1, Leu 2A (1) 2 y NB 1.1, con una similitud del 60% (Dsm=0.4) respecto al Grupo I, incluyendo cuatro cepas de referencia: B. japonicum DSMZ 3011, B. canariense ]]>
Bradyrhizobium sp. CIAT 2453 y B. elkanii USDA 76. Todos mostraron resistencia a los 10 antibióticos ensayados, excepto NB 1.1 (subgrupo IIb), el cual fue susceptible a amikacina. En total el 66% de los aislamientos fueron resistentes a todos los antibióticos ensayados.
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El Grupo III (Fig. 2B) integrado por A. tumefaciens C58, se separó de los grupos anteriores con un Dsm=0.53 (47% de similaridad), siendo susceptible a cloranfenicol, amikacina y kanamicina, pero resistente a ampicilina (200µg/mL).
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El Grupo IV, presentó un Dsm=0.85 apenas con un 15% de similaridad respecto a los grupos restantes y lo conformó únicamente el aislado Trébol (Fig. 2B), susceptible a los antibióticos amikacina, doxiciclina, kanamicina streptomicina y tetraciclina; solo presentó resistencia a las concentraciones más bajas de gentamicina (2.5µg/mL), ]]>
µg/mL) cloranfenicol (50µg/mL) y ácido nalidíxico (5-25µg/mL).
Análisis fenético general de las cepas: Se elaboró un dendrograma con 94 ]]>
Fig. 2C):
El Grupo I (25% de rizobios ]]>
P. vulgaris L., (Dsm=0.07), mostró un alto grado de similaridad (93%) a R. tropici CIAT 899.
Los microsimbiontes Rm V, Rm B (subgrupo Ib), presentaron características similares a los rizobios S. meliloti 41 y
S. americanum CFN-EI 156, con una similitud al subgrupo I del 80% Dsm=0.20, excepto que Rm B no fue tolerante a pH inferiores a 5.0 (Cuadro 4 y 5). El subgrupo Ic incluyó solo a A. tumefaciens C58.
El Grupo II (66%), ]]>
Bradyrhizobium y se subdividió en 2 subgrupos: El subgrupo IIa incluyó a Nod 2R con 85% de similaridad (Dsm=0.15) (Fig. 2C) a B. japonicum DSMZ 30131 y B. ]]>
BTA-1 (Cuadro 4, 5), así como también a los aislados de diversos suelos del país (NB 4.1, NB 15.1, NB 23.1 y NB 2.1, NB1.1 (Dsm=0.13-0.27), con una similaridad mayor del 70% a las cepas de referencia menos tolerantes a las condiciones salinas, Bradyrhizobium sp. CIAT 2453 y B. elkanii USDA 76 (
Fig. 2C), (Cuadro 5). El subgrupo II b, conformado por Leu 2A (1)2 y NB 9.1, se separó de los subgrupos anteriores por presentar una similaridad igual o menor al 70% (Dsm=0.3). Los aislados que lo integran se caracterizaron por crecer en medios con un pH entre 5.0-6.6 y no en concentraciones de NaCl mayores a 0.1 y 1% respectivamente (Cuadro 5).
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El Grupo III (8.3%), separó el aislado Trébol con el más bajo nivel de similaridad respecto a los demás grupos 44% (Dsm=0.56) (Fig. 2C), el cual se diferenció de los restantes por poseer los límites de tolerancia más estrechos a condiciones extremas; creció a pH iguales o superiores a 5.6, condiciones de salinidad (0.1% NaCl), temperaturas entre 22°C y ]]>
Cuadro 5), además fue el aislado que mostró susceptibilidad a 50% de los antibióticos ensayados.
Caracterización molecular: También se detectó la presencia de un megaplásmido de tamaño aproximado a 279 Kb, en siete cepas rizobianas ]]>
Rhizobium tropici CIAT 899 (Fig. 3). La línea cinco de esta figura correspondió a Rm B, donde no se detectó megaplásmidos con el método utilizado.
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Los amplificados del ADN ribosómico 16S de los doce aislados autóctonos, nueve cepas de referencia y Pseudomonas fluorescens BIOMI ALQ 7, originaron una banda de 1 500pb aproximadamente.
La restricción con: Msp I, ]]>
sa I, Hha I y Sau 3A I, generó un patrón de 5, 6, 10 y 10 bandas, respectivamente. En el análisis sólo se incluyeron las bandas apreciables de tamaño comprendido entre 125pb y 800pb (Fig. 4B).
Los perfiles de ]]>
Cuadros 5, 6). El orden numérico de los genotipos se hizo con base al dendrograma (Fig. 4A).
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Las enzimas de restricción, Msp I, Hha I, y Sau 3AI(i-ii), permitieron detectar un mayor polimorfismo en el gen ribosómico 16S, lo cual logró definir diversos genotipos (Fig. 4B).
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El análisis estadístico de los ensayos de restricción realizados con los amplificados, permitió la separación de tres grupos (Fig. 4A): El Grupo A conformado por el 42%, de los microsimbiontes de crecimiento rápido-muy rápido, en su mayoría productores de ácido, excepto Leu 2A(1)2. Se evidenció que ME 01era 100% similar a R. tropici CIAT 899 y que los aislados Rm V y NB 23.1, eran idénticos a
S. americanum CFN-EI 156. El rizobio nativo Leu 2A(1)2, se presentó como un genotipo diferenciado, muy relacionado en un 97% (Dsm=0.03) a los dos aislados anteriores. Finalmente, Rm B presentó un perfil polimórfico característico generado por Sau 3AI, Rsa I, y Msp I, relacionado en un 80% (Dsm=0.20) ]]>
R. tropici CIAT 899 y S. americanum CFN-EI 156.
En el Grupo B se incluyeron 50% de los aislados analizados conformado por microsimbiontes de crecimiento lento productores de álcali, donde dos aislados autóctonos NB 2.1 y NB1.1 y la cepa de referencia
B. canariense BTA-1 conformaron una terna 100% similar entre sí. En este grupo se identificó el genotipo, NB 9.1, muy relacionado con la cepa de referencia citado anteriormente con un bajo índice de disimilaridad (Dsm=0.1), lo ual representa un 90% de similaridad respecto a la terna anterior.
El microsimbionte ]]>
B. japonicum DSMZ 30131 y Bradyrhizobium canariense BTA-1 y el análisis de polimorfismo del gen 16Sr (PCR-RFLP) también reveló que está relacionado con un alto grado de similaridad 97% (Dsm=0.03) con Bradyrhizobium japonicum DSMZ. La ]]>
sm=0.25) y el microsimbionte NB 4.1, mostró un 80% de similaridad (Dsm=0.2), con Bradyrhizobium elkanii USDA 76.
El Grupo C, separó ]]>
Discusión
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Las cuatro categorías establecidas en relación a la velocidad de crecimiento de los 12 aislados, basadas en el tiempo en que fueron apreciables las colonias, mostraron divergencias con los resultados planteados por Jordan (1984) & Rodríguez-Mendoza (1993), quienes señalaron solo 2 categorías: cepas de crecimiento rápido y lento, a pesar de emplear el mismo criterio. En este sentido, la clasificación propuesta por Jordan en 1984, no indicó formas extremas o intermedias, probablemente debido al ]]>
et al. 1995), además, se conoce la existencia de un grupo de rizobios no simbióticos presentes en él (Sullivan et al. 1996). Este criterio es relativo y subjetivo ]]>
et al. 2000), puesto que va a depender en parte de las condiciones del medio de cultivo, las cuales son: composición, pH, temperatura y origen de la cepa, sean provenientes de un aislamiento nodular o de repiques frecuentes de cepas ya aisladas y conservadas en el laboratorio, factores que modifican la velocidad de crecimiento. En general, a medida que se avanza en los estudios de diversidad rizobiana, se reconocen más categorías (intermedias y más extremas) en cuanto a la velocidad de crecimiento (Odee et ]]>
. 1997), lo cual indica la heterogeneidad en los patrones de crecimiento.
El análisis fenotípico incluyó los aislados NB 23.1 y Leu 2A (1)2 de crecimiento rápido en el grupo Bradyrhizobium de crecimiento lento. Esta contradicción se explicaría por no incluirse en estos análisis la velocidad de crecimiento como ]]>
Sinorhizobium. americanum CFN-EI 156, también de crecimiento rápido (Fig. 4A) y podría referirse al simbionte Leu 2A(1)2, aislado de Leucaena leucocephala (planta introducida en Venezuela), como un rizobio propio de la zona tropical de crecimiento rápido, esta última ]]>
Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium y Agrobacterium, lo cual ha sido determinado mediante análisis de PCR-RFLP del ADNr 16S y el ITS de la ]]>
establecimiento en suelos tropicales según Bala et al. (2003).
En el presente estudio, se demostró que los aislados rizobianos de crecimiento ]]>
Rhizobium meliloti (Sin. S. meliloti) (Munns & Keyser 1981), menos tolerantes a pH ácidos, en comparación a las bacterias de crecimiento lento del género Bradyrhizobium. No obstante, se ha ]]>
R. loti y R. tropici pueden crecer a pH 4.0 (Martínez-Romero et al. 1991). Los resultados de este trabajo también demostraron que R. tropici y R. etli CFN42 toleraron un pH entre 4.0 y 4.4 respectivamente (Cuadro 5). Valores similares se registraron en un ]]>
R. etli aisladas de suelos de Egipto, en donde la mayoría eran capaces de sobrevivir a pH 4.7 y R. tropici CIAT 899 a pH 4 (Shamseldin & Werner 2005). Este hecho fue valedero para las cepas de referencia S. americanum CFN-EI 156 y S. meliloti 41, todas de crecimiento rápido al igual que los ]]>
La tolerancia a la salinidad es otra propiedad presente en las cepas autóctonas de crecimiento rápido pertenecientes al género Rhizobium en relación a los simbiontes de crecimiento lento del género ]]>
Bradyrhizobium, de tal manera que coincide con lo señalado por Elsheikh & Wood (1995), Odee et al. (1997) y Shamseldin & Werner (2005). Los dos últimos autores señalaron que dos de las cepas de R. etli (EBRI 21 y EBRI 26), aisladas de los suelos de Egipto mostraron ser tolerantes a elevadas concentraciones salinas (4% NaCl) y estaban adaptadas a altas temperaturas (42ºC). ]]>
El 25% de los aislados fueron tolerantes a temperaturas altas (40ºC), siendo 27ºC- 35ºC el rango óptimo para el crecimiento de la mayoría de estos simbiontes, diferente al señalado por Ek-Jander & Fahraeus (1971), (28ºC-31ºC), sin embargo, se ha citado que el óptimo para R. meliloti es 35ºC (Allen & Allen 1950). Inclusive se ha demostrado la ]]>
P. vulgaris a 45ºC (KüçüK et al. 2006) y de cepas tipo como R. tropici a 40ºC (Martínez-Romero et al. 1991).
Los tres aislados autóctonos, ME 01, Rm V y Rm B, se pueden considerar como cepas que poseen amplios límites de tolerancia a determinadas ]]>
et al. (2010) para especies del género Rhizobium, Ensifer y
Phyllobacterium. Según Jordán (1984), la mayor susceptibilidad es característica del género Rhizobium a diferencia de las cepas de crecimiento lento del género Bradyrhizobium, las cuales han mostrado un espectro más amplio de resistencia a los antibióticos en cuanto al número y concentraciones ensayadas. Estos resultados son semejantes a los registrados en este trabajo, donde el 66.6% de los aislados afines al género ]]>
Bradyrhizobium, presentaron resistencia a los 10 antibióticos aplicados, sin embargo, se contraponen a lo señalado por Odee et al. (1997).
Por otra parte, los análisis fenotípicos revelaron un alto porcentaje de similaridad con el análisis del polimorfismo de los RFLP del ADN ]]>
Cicer arietinum L., donde los autores registraron tres grupos al analizar numéricamente las características ]]>
Mesorhizobium (Maâtallah et al.2002).
De esta forma, en este análisis no se encontraron diferencias en cuanto al número y tamaño de los plásmidos de los rizobios ]]>
Asimismo, se detectó un plásmido de aproximadamente 279Kb en la cepa tipo B (
R. tropici CIAT 899), mediante la técnica de Casse et al. (1979) (Fig. 3), la cual nos permite identificar plásmidos cercanos a los 300 Kb. Sin embargo, en los 2 subgrupos A y B de R. tropici, CFN299 y CIAT 899 respectivamente, ha sido visualizado mediante el método de Eckhardt (1978), un megaplásmido mayor de 1000Kb no homólogo (subgrupo específico) (Geniaux ]]>
et al. 1995). De igual manera se ha evidenciado un plásmido de 200Kb en la cepa tipo A (CFN 299), pero no en la tipo B (CIAT 899) (Martínez-Romero 2003).
El análisis del Polimorfismo de los RFLP del ADN ribosómico 16S, arrojó los siguientes resultados: el 50% de los 12 aislados eran similares al ]]>
Bradyrhizobium, un 42 % estaban relacionados con los géneros Rhizobium y Sinorhizobium, de ellos un 8% era idéntico al primer género, un 25% similares al segundo y el 8.3% restante era afín a ambos. Esta es una técnica adecuada para agrupar cepas a nivel de especies o géneros, además puede ser usada para encontrar nuevos taxa potenciales o clasificar filogenéticamente un vasto ]]>
et al. 1998). Sin embargo, los patrones genómicos de un solo loci, en este caso el gen 16Sr, no reflejan la complejidad del genoma de Rhizobium, el cual está generalmente fraccionado en varios replicones.
El aislado Trébol (8.3%) ]]>
Pseudomonas fluorescens BIOMI AlQ 7. Este microsimbionte reveló un patrón de restricción característico, y sugiere la probabilidad de tratarse de una bacteria endémica de los suelos venezolanos, que adquirió los genes simbióticos por transferencia horizontal, capaz de nodular a
Trifolium sp., una planta introducida en Venezuela. En este sentido, Liu et al. (2007) demostraron que varias especies de Trifolium que crecían en la región subtropical y tropical de China, se asociaban a diversos especies rizobianas pertenecientes a Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium, sugiriendo la ]]>
Trifolium, hayan sido transferidos desde R. leguminosarum a otras cepas rizobianas, contrario a lo afirmado por Jordan (1984), quien señaló en ese momento que R. leguminosarum bv. trifolii era el único grupo rizobial asociado a Trifolium ]]>
La transferencia horizontal de genes simbióticos es un evento que ha sido evidenciado entre rizobios, que le confiere una ventaja ecológica a aquellas que lo han adquirido, para establecer una simbiosis efectiva con especies de leguminosas introducidas o exóticas (Barcillos et al. 2007). También se ha sugerido que la transferencia ]]>
Crotalaria spp., pertenecientes al género Methylobacterium y donde se ha mostrado que el gen Nod A de Methylobacterium nodulans está estrechamente ]]>
Bradyrhizobium (Sy et al. 2001).
Las características fenotípicas y genotípicas tan particulares que presentó el aislado Trébol, con baja similaridad a las cepas rizobianas de referencia bajo estudio, aunado al hecho de ser un microsimbionte capaz de crecer en YMm líquido con NH4NO3 ]]>
et al. (2001).
]]>
El análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción permitió reconocer que P. vulgaris L. puede ser nodulada por 2 géneros rizobianos con características fenotípicas y genotípicas diferentes: un simbionte muy similar a R. tropici CIAT 899 y otro a B. japonicum DSMZ 30131(ME 01, Nod 2R ]]>
B. japonicum además de otros géneros rizobianos que incluyen R. etli, R. tropici, S. fredii, M. loti, R. leguminosarum bvs. trifolii y viciae,
S. meliloti y Rhizobium spp., ya han sido señaladas por Bromfield & Barran (1990) y Michiels et al.(1998) como un hospedador no selectivo, aunque la mayoría de estas asociaciones no eran efectivas. Sin embargo, el aislado Nod 2 R resultó ser un microsimbionte eficiente en cuanto a la capacidad fijadora de nitrógeno (datos no publicados). ]]>
Resultados negativos en la nodulación, como el que obtuvimos, también han sido señalados en la simbiosis Rhizobium-P. vulgaris L. considerado este último también como un hospedador promiscuo (Michiels et al. 1998), aunque con un grado de preferencia ]]>
et al. 1984, Aguilar et al. 2001), donde se sugiere que la baja infectividad en esta asociación simbiótica, posiblemente se deba a fallas en la interacción entre la bacteria y planta huésped, tal como ha sido señalado por Bernal & Graham (2001).
En diversas regiones de la China ]]>
Agrobacterium tumefaciens y tres grupos del género Bradyrhizobium, uno de ellos B. japonicum, además de R. leguminosarum bv. phaseoli, en P. vulgaris, Campylotropis spp. y Cassia spp. Los mismos autores han señalado este hecho como un caso de evolución ]]>
P. vulgaris en los suelos de China eran completamente diferentes a las de México, el sitio de origen de P. vulgaris (Han et al.2005).
Los dos aislados autóctonos ]]>
Sinorhizobium meliloti 41 (82%) y a Sinorhizobium americanum CFN-EI 156 (88%) respectivamente. Sin embargo, el perfil de restricción incluyó a Rm V en el grupo de S. americanum CFN-EI 156 (100% similares) y a Rm B en un genotipo diferente con 80% de similaridad a las cepas de referencia de ]]>
R. tropici CIAT 899 y S. americanum CFNEI 156. Estos resultados son apoyados por los encontrados por Bromfield et al. (2010), quienes han señalado a Medicago sativa como una leguminosa, cuyos nódulos estaban ocupados por varios genotipos bacterianos, pertenecientes a los géneros Ensifer, Rhizobium y
Phyllobacterium, este último considerado como oportunista.
Los resultados de nuestro trabajo concuerdan con algunos estudios realizados en regiones tropicales por varios autores, en el sentido de hallar una diversidad de especies rizobianas formadoras de nódulos en varias leguminosas, presentes en diferentes localidades. Ellos han indicado que los ]]>
2 (Menna et al. 2006), y surge la idea de considerarlos como un centro de biodiversidad y diversificación de bacterias que se asocian simbióticamente con las leguminosas (Lafay & Burdon 2007).
Finalmente, en suelos y ]]>
Rhizobium, Bradyrhizobium y Sinorhizobium, adaptados a distintas condiciones ambientales, que abarcan un amplio rango de pH del suelo desde 4.7 a 8.2 (datos no publicados), lo que representa una extensa distribución geográfica que comprende la región centro occidental y sur oriental del país. Por ]]>
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico Humanístico y Tecnológico (CDCHT) de la Universidad de Los Andes, Mérida- Venezuela, proyecto C-725-95-03-D. Agradecemos A Esperanza Martínez-Romero por donar gentilmente las seis cepas rizobianas de referencia. Al laboratorio de Biotecnología ]]>
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Correspondencia a: María Eugenia Marquina, Néstor Enrique González & Yulimar Castro. Laboratorio de Fijación Biológica de Nitrógeno y Cultivos de Tejidos Vegetales in vitro, Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Los Andes. Núcleo Pedro Rincón Gutiérrez, Edificio A, 2º piso, La Hechicera, Mérida, Venezuela; martu@ula.ve, ngonzalezv2007@gmail.com, yulica@gmail.com
