Javier Hernández-Guzmán¹, Lenin Arias-Rodriguez¹ & Jeane Rimber Indy^1,2

1. División Académica de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México; jhernandez-guzman@hotmail.com, leninariasrodriguez@hotmail.com
2. Laboratory of Aquaculture, Campus Bahu, Sam Ratulangi University, Manado, Indonesia; jeanerimberindy@yahoo.com

Dirección para correspondencia

Meiotic chromosomes of the tree frog Smilisca baudinii (Anura: Hylidae). The Mexican tree frog Smilisca baudinii, is a very common frog in Central America. In spite their importance to keep the ecological equilibrium of the rainforest, its biology and genetics are poorly known. In order to contribute with its biological knowledge, we described the typical meiotic karyotype based in standard cytogenetic protocols to specimens collected in Tabasco, Mexico. The study was centered in the analysis of 131 chromosome spreads at meiotic stage from two adults of the species (one female and one male). The metaphase analysis allowed the establishment of the modal haploid number of 1n=12 bivalent chromosomes. The chromosomic formulae from the haploid bivalent karyotype was integrated by 12 biarmed chromosomes characterized by twelve pairs of metacentric-submetacentric (msm) chromosomes. The meiotic counting gives the idea that diploid chromosome number is integrated by a complement of 2n=24 biarmed chromosomes. The presence of sex chromosomes from female and male meiotic spreads was not observed. Current results suggest that S. baudinii chromosome structure is well shared among Hylidae family and "B" chromosomes are particular structures that have very important evolutionary consequences in species diversification. Rev. Biol. Trop. 59 (1): 355-362. Epub 2011 March 01.

Key words: Hylidae, Smilisca baudinii, karyotype, chromosome, meiosis.

La rana arborícola mexicana Smilisca baudinii, es una especie de rana común en Centroamérica. Sin embargo, la biología y genética de la especie, es pobremente conocida a pesar de su importancia para mantener en equilibrio ecológico las selvas tropicales. Con el propósito de contribuir con el conocimiento biológico de esta especie, establecimos el cariotipo típico en meiosis en especímenes recolectados en Tabasco, México, mediante procedimientos citogenéticos estándares. El estudio, se fundamentó en el análisis de 131 dispersiones cromosómicas en estadio meiótico de dos adultos de la especie (una hembra y un macho). El análisis de las metafases, permitió establecer el número modal haploide de 1n=12 cromosomas bivalentes. La fórmula cromosómica del cariotipo haploide, se integró por 12 cromosomas birrámeos caracterizado por 12 pares de cromosomas bivalentes metacéntricos-submetacéntricos (msm). Los conteos en meiosis, hacen suponer como número diploide de cromosomas a un complemento integrado por 2n=24 cromosomas birrámeos. No fue posible observar presencia de cromosomas sexuales, entre las dispersiones meióticas del espécimen hembra y macho. Los resultados sugieren que la estructura cromosómica de S. baudinii, es compartida ampliamente entre las especies de la familia Hylidae y los cromosomas "B" son estructuras importantes en la diversificación de las especies.

Palabras claves: Hylidae, Smilisca baudinii, cariotipo, cromosoma, meiosis.

En México, se ha reportado una amplia diversidad de anfibios con 290 especies registradas, ocupando el cuarto lugar en el mundo (Faivovich et al. 2005, Sánchez & Barba 2005). De dichas especies, diez se han registrado en el sureste de México particularmente en Tabasco (Reynoso-Rosales et al. 2005). Del grupo de los anuros (ranas y sapos) la familia Hylidae es la que posee mayor diversidad, con un total de 870 especies reportadas en el planeta hasta el 2005 (Faivovich et al. 2005, Frost et al. 2006). Los estudios sobre anfibios, se han basado principalmente en descripciones taxonómicas, distribución geográfica y dinámica poblacional (Busin et al. 2001, 2008, Duellman 1956, Faivovich et al. 2005, Reynoso-Rosales et al. 2005, Santos et al. 2009, Lynch 2006, Wiens et al. 2005). En lo que respecta a estudios de citogenética, son poco frecuentes en el grupo a pesar de ser caracteres importantes en muchos casos, clave para la comprensión de varios aspectos de biología básica, la dilucidación de problemas taxonómicos, procesos evolutivos, hibridación y mecanismos de determinación del sexo (Ananias et al. 2004, Busin et al. 2001, 2008, Córdova 1993, Faivovich et al. 2005, Gruber et al. 2005). Por otro lado, se ha encontrado que los estudios de citogenética, son un instrumento importante para la detección de daño al genoma por probable contaminación del medio acuático (Arias-Rodriguez et al. 2007, 2008, Álvarez-Morales 2009, D´artola-Barceló 2009, Hernández-Guzmán 2009, Herrera-Navarrete 2009).

En México, los estudios de citogenética de anfibios, se restringen al trabajo del sapo común Chaunus marinus (Hernández-Guzmán 2009). Mientras que en el resto de especies, los fundamentos básicos de citogenética continúan como una incógnita, que es importante discernir en estudios posteriores para el establecimiento de planes de conservación y aprovechamiento de las especies nativas, por ello en este documento se presenta por primera ocasión la estructura de los cromosomas meióticos de la rana arborícola mexicana S. baudinii.

Sitio de recolecta y clasificación taxonómica: Dos especímenes adultos de S. baudinii, una hembra y un macho, fueron recolectados en la zona urbana de la Villa Luís Gil Pérez (17º52’43.05’’ N - 93º04’25.03’’ W) en el municipio del Centro de Tabasco. La determinación taxonómica de los ejemplares, se realizó con base en los caracteres merísticos y morfométricos señalados por Flores-Villela et al. (1995).

Procedimiento citogenético: La técnica citogenética empleada, fue una adaptación de la recomendada por Arias-Rodriguez et al. (2008, 2009). Luego de dos días posteriores a su captura, los especímenes fueron tratados por seis horas con 40 μg/g de peso de una soluciσn de colchicina al 0.1% disuelta en citrato de sodio al 0.1% y posteriormente, fueron sacrificados por hipotermia obteniéndose el tejido gonádico. Los tejidos, fueron hidratados en una solución de citrato de sodio al 1.0% y durante 60min a 38.0±1.0ºC; prefijados adicionando (en proporción 1:1) al agente hidratante, la solución de metanol frío (4ºC): ácido acético (4:1) y mantenidos en refrigeración (4.0ºC) durante 96hr. Posteriormente, los tejidos fueron limpiados por medio del centrifugado a 4.0ºC durante 10min a 7 000rpm y el sobrenadante fue reemplazado por el fijador 4:1. La operación anterior, se repitió por cinco veces hasta que los tejidos adoptaron coloración blanquecina y fueron mantenidos en refrigeración (4ºC) por mes y medio.

Los tejidos fijados, se gotearon sobre series de portaobjetos que fueron previamente colocados en etanol refrigerado (4ºC), y desde una altura aproximada de 1.70m, lo que permitió la dispersión adecuada de los cromosomas.

Las preparaciones, fueron teñidas con giemsa diluida al 10% en buffer de fosfatos a pH 7.0 durante 30min (38.0±1.0ºC) y analizadas con el microscopio Zeizz Axiostar Plus con el objetivo 40X. Las mejores dispersiones cromosómicas, fueron fotodigitalizadas con la cámara DSC-W30-Sony con el objetivo 100X. Todas las imágenes, fueron mejoradas con el empleo de los filtros RBG del programa Adobe Photoshop CS 8.01^©.

El cariotipo, se construyó considerando la proporción de brazos r=q/p, índice centromérico i=100(p/p+q) y la diferencia entre brazos d=r-1(10/r+1) (Levan et al. 1964). El ideograma en meiosis, se trazó con el programa Microsoft^© Office Excel 2003 y basado en las longitudes promedio en μm de p+q de cada par cromosómico.

Veintidós preparaciones cromosómicas, del tejido gonádico se observaron microscópicamente y fueron fotodigitalizadas 131 dispersiones cromosómicas en meiosis. Del análisis anterior, 96 células mostraron el número haploide de 1n=12 cromosomas bivalentes, lo que representó el 73.3% (y la moda haploide) del total de dispersiones analizadas (Fig. 1).

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Por otro lado, se observaron en ambos especímenes y con baja frecuencia variaciones en los conteos del número de cromosomas de 13, 14 y 24 elementos cromosómicos (Fig. 1, 2).

A partir de las observaciones microscópicas, se logró observar dos estándares de dispersiones cromosómicas en meiosis II. La primera, se caracterizó por mostrar cromosomas bivalentes en forma de anillo en profase temprana, típico de la ovogénesis (Fig. 3A) y la segunda por la presencia de cromosomas bivalentes en metafase II, que caracteriza la espermatogénesis (Fig. 3B). ]]>

Las longitudes promedio en micrométros de cada uno de los doce pares cromosómicos del cariotipo profasico, se aprecian en el Cuadro 1. Las medidas variaron desde el par uno con 13.9±3.45μm y hasta el par doce con 5.10±0.90μm. Mientras, las longitudes promedio de p+q de cada uno de los elementos cromosómicos del cariotipo metafísico II, se observan en el Cuadro 2 y al igual que el cariotipo anterior, variaron desde el par uno de 9.60±2.52μm y hasta el par doce de 4.50±0.50μm.

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En las dispersiones cromosómicas en meiosis del macho y la hembra de S. baudinii, no fue posible observar presencia de heteromorfismo cromosómico como criterio para establecer la probable presencia de cromosomas sexuales en la especie.

Pese a la inexistencia de estudios de citogenética en las ranas de México, los resultados del número modal haploide 1n=12 cromosomas en meiosis obtenidos en S. baudinii demuestran que la condición de ploidía reportada, es un parámetro citogenético común en algunos géneros (Hyla, Scinax, Sparasphenodon, Itaponithyla, Hypsiboas) de la familia Hylidae (Cuadro 3) (Faivovich et al. 2005) y probablemente es una condición única para los miembros del género Smilisca.

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Faivovich et al. (2005) señala, que los datos citogenéticos disponibles para miembros de la familia Hylidae, se integran por el clado que agrupa a Scarthyla, Scinax, Sphaenorhynchus, "pseudidos’’, y las Hyla, especies con 30 cromosomas en condición mitótica. Sin embargo, en dicho trabajo, no fueron considerados para el análisis filogenético, los géneros con cariotipo de 2n=24 cromosomas y su inclusión, probablemente permitiría reagrupar los clados y relaciones filogenéticas desde la perspectiva citogenética en grupos más acordes con el origen y dispersión de los Hylidae.

Las variaciones del número de elementos cromosómicos señalados en la Fig. 1, son un atributo que ha sido observado únicamente en Hyla sp. (aff. circumdata) (Baldissera-Junior et al. 1993). La presencia de uno o dos cromosomas adicionales al complemento cromosómico haploide en meiosis, se ha interpretado como cromosomas supernumerarios ó cromosomas tipo "B" (Jones & Rees 1982). Los cromosomas supernumerarios, observados en S. baudinii, son los elementos más pequeños (1.05±0.15) del cariotipo típico de la rana arborícola. Por otro lado, la morfología fue diferente a la del resto de elementos lo que hace suponer su condición univalente en las células meióticas como se ha observado en otras especies (Jones & Rees 1982, Beukeboom 1994, Palestis et al. 2004). Dichos atributos, ratifican que se trata de cromosomas tipo "B", lo que implica, que su presencia sea de carácter natural y normal en algunas especies de la familia Hylidae.

Los cromosomas "B" supernumerarios, tienen implicaciones importantes durante la historia evolutiva y formación de nuevas especies, dado que la ganancia o perdida de fragmentos de ADN incluyen cambios importantes en la reestructuración del contenido y funcionamiento del genoma de las especies (White 1954, Jones & Rees 1982, Beukeboom 1994, Camacho et al. 2000, Fagundes et al. 2004, Granado et al. 2004, Palestis et al. 2004). Lo anterior, probablemente ha sido un mecanismo importante durante la especiación en la familia Hylidae, por ello la ampliación de los estudios de citogenética en otras especies de ranas del sureste de México permitirá mayor comprensión del valor biológico y evolutivo de los cromosomas supernumerarios.

La morfología cromosómica, del cariotipo típico de S. baudini en meiosis, se estableció para el complemento haploide como cromosomas birrámeos de tipo metacéntrico-submetacéntrico (msm) que se caracterizaron por presencia de doce pares de cromosomas bivalentes. Los cromosomas birrámeos (m y msm), es una condición común en las especies de la familia Hylidae (Cuadro 3), lo que se traduce en relaciones filogenéticas compartidas no solo por mantener número cromosómico similar, si no que además por conservar fórmula cromosómica constante y como se ha manifestado en varias especies de ranas arborícolas de Brasil, Estados Unidos de América, Armenia y Arabia Saudita (Cuadro 3).

En conclusión, el número haploide en la rana arborícola mexicana S. baudinii es de 1n=12 cromosomas, por lo que se asume que en condición diploide en mitosis el cariotipo debe estar integrado por 24 cromosomas birrámeos de tipo msm. La presencia de cromosomas sexuales, fue descartada en esta especie, debido a la carencia de atributos morfológicos para identificar heteromorfismo entre las dispersiones meióticas del espécimen hembra y macho.

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