Olga G. Martínez
Herbario MCNS, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Salta, Av. Bolivia 5150, 4400 Salta, Argentina; martinezog@gmail.com
Abstract: Gametophytes and young sporophytes of four species of the fern genus Pteris (Pteridaceae) naturalized in the American continent. The pantropical fern genus Pteris L. has about 250 species of which 60 occur in the American continent. We studied the morphogenesis of the gametophyte, and the morphology of the young sporophytes of four species: P. cretica, P. ensiformis, P. multifida and P.vittata, together with a palynological analysis that includes the ability of spores to germinate. Gametophytes were obtained trough in vitro culture techniques with agar-gellified Knudson medium. Young sporophytes were placed in earth-sand (3:1) sterile substrate. We used light and SEM microscopy. Triletes spores predominate, but monolete, tetralete, and other types of apertura are often found. The viability of spores is not affected by the variation, so the term spore polymorphism is applied to the condition occurring among these species. Spore polymorphism is similar in P. cretica and P. multifida. Germination occurs following the Vittaria type, 3-7 days after the sowing. Filamentous, 3-5 celled gametophytes were found in P. cretica, P. multifida and P. vittata, and 7-9 celled in P. ensiformis. Development of gametophytes takes place following Adiantum type and eratopteris type. The symmetry of the laminae differ in gametophytes, those of P. ensiformis and P. multifida are similar and differ from the other two species, P. cretica and P. vittata. Gametophytes of P. ensiformis, P. multifida and P. vittata are bisexual and protandric, while male gametophytes were found in P. cretica. Antheridia correspond to the common leptosporangiate type; they are cylindric in P. vittata and ovoid in the other three species. Archegonia necks have 4 rows of 4 cells each. The sporophytes complete their development 3 months after sowing, and have indument close to the adult plants. P. cretica shows obligated apogamy. Rev. Biol. Trop. 58 (1): 89-102. Epub 2010 March 01.
Key words: Pteris, spores, gametophyte development, young sporophytes, apogamy.
El género Pteris L. es pantropical; reúne aproximadamente 250 especies, 60 de las cuales crecen en América. Smith et al. (2006) consideran que el origen de este género probablemente no sea monofilético.
Este trabajo tiene como objetivo brindar información sobre la morfogénesis de los gametófitos de cuatro especies de Pteris L. naturalizadas en el continente americano, P. cretica L, P. ensiformis Burm.f., P. multifida Poir. y P. vittata L. Se realizó además un análisis palinológico relacionado con la viabilidad de las esporas y una descripción de la estructura de los esporófitos jóvenes.
Algunos aspectos de la fase sexual de estos helechos han sido abordados por distintos autores. Laird & Sheffield (1986) analizaron la estructura de los gametangios y su relación con la apogamia en P. cretica; Kawakami et al. (1995) indujeron la formación de esporófitos apogámicos y estudiaron su morfología en P. multifida. La especie más estudiada es P. vittata. Ito (1962) determinó la capacidad de regeneración de los gametófitos de esta especie; Kato (1963, 1969) obtuvo callos sometiendo a los gametófitos a períodos de oscuridad y estudió, experimentalmente, el efecto de varios factores sobre ellos; Beri & Bir (1993) determinaron los cambios bioquímicos producidos por el almacenamiento de las esporas; Prada et al. (2008) aportaron datos sobre la expresión sexual de P. vittata en relación con el medio de cultivo y Zhang et al. (2008) describieron el desarrollo de los gametófitos de P. ensiformis y P. vittata, entre otras especies prevenientes de China.
Los aportes a la palinología de especies aquí estudiadas fueron realizados por Nayar et al. (1964), Erdtman & Sorsa (1971), Huang (1981), Tryon & Tryon (1982), Michelena (1989), Tryon & Lugardon (1991) y Arreguín- Sánchez (1997). La variabilidad morfológica de las esporas en Pteris fue presentada por Sladkov (1957), Nayar & Devi (1966), Devi (1977) y Martínez & Morbellli (2009), aunque ninguno de ellos hace referencia a la viabilidad de estas esporas atípicas.
Algunos aspectos morfológicos de los esporófitos jóvenes de Pteris fueron descritos por Mendoza et al. (1997) para P. berteroana Agardh. Huang et al. (2006) compararon esporófitos jóvenes de ejemplares diploides y triploides de P. fauriei Hieron y Letelier & Peñailillo (2007) se refirieron a P. chilensis Desv.
]]> Pteris presenta dificultades en la determinación de sus especímenes, por lo que el aporte de estudios de las primeras etapas de desarrollo del esporófito podría contribuir a un mejor conocimiento del grupo con datos que caractericen a sus taxones y permitan determinarlos desde etapas tempranas en su ambiente natural.Material y métodos
La obtención de gametófitos se realizó mediante cultivos in vitro. Los ejemplares de referencia se depositaron en el Herbario "Museo de Ciencias Naturales de Salta", Salta, Argentina (MCNS). Material estudiado: P. cretica: ARGENTINA: Salta, Quebrada Los Berros, Martínez 820. P. ensiformis: EEUU: California, Los Angeles, MCNS 1814. P. multifida: EEUU: California, Los Angeles, MCNS 1810. P. vittata: ARGENTINA: Jujuy, Libertador General San Martín, Martínez 1399.
Las esporas fueron separadas de restos vegetales con una malla con poros de 80μm, desinfectadas con hipoclorito de sodio 10% acuoso durante 10 minutos y sembradas durante las 2 primeras semanas desde su colecciσn. Se utilizó solución nutritiva de Knudson (modificada por Steeves et al. 1955) gelificada con agar 10g/l, con pH ajustado a 6 con ClH, KOH o NaOH al 1%, y esterilizada en autoclave durante 20 minutos a 1 atmósfera de presión.
La siembra se realizó en cápsulas de Petri de 5cm de diámetro y los repiques de gametófitos en frascos de 5cm de diámetro por 7cm de alto. Los cultivos se mantuvieron estériles durante un año en cámara de cultivo a 25±2ºC con fotoperíodo de 16 horas de intensidad luminosa de 10W.m-2. Los esporófitos fueron trasladados a un sustrato estéril formado por 3 partes de tierra y 1 de arena donde se mantuvieron seis meses.
Para el análisis palinológico se consideraron el diámetro polar (DP) y el diámetro ecuatorial (DE) incluidas las ornamentaciones de la pared, salvo en P. ensiformis. Las medidas son el resultado del promedio de 20 mediciones por cada ejemplar. Para la descripción de la ornamentación se utilizaron las propuestas de Lellinger & Taylor (1997) y Punt et al. (2007). El contenido celular en las esporas se determinó con carmín acético. El estudio palinológico con microscopía de luz se realizó sobre esporas montadas en gelatina-glicerina y, para su estudio, con microscopía electrónica de barrido con esporas montadas sobre tacos de metal con cinta adhesiva doble faz.
Para la obtención de cortes histológicos el material fue fijado y deshidratado con alcohol etílico según D`Ambrogio de Argüeso (1986). La inclusión se realizó en paraplast y los cortes con un espesor de 10μm. Para la coloraciσn se empleσ Hematoxilina de Heindenhain y, para el montaje, Bálsamo de Canadá natural.
Para visualizar los gametangios se colocó el material en una solución de hidrato de cloral con unas gotas de fucsina básica (Rodríguez- Ríos 1973) o carmín acético (Klekowski 1969). La presencia de aceites durante la germinación fue determinada con Sudan IV. Para la observación con microscopio electrónico, los gametófitos se fijaron en glutaraldehido al 2.5% en buffer fosfato y los esporófitos, en F.A.A. (formol, alcohol, ácido acético).
Las frondas juveniles se aclararon con hipoclorito de sodio comercial, diluido en agua en proporción 1:1, y se colorearon mediante la técnica de Foster (1934).
Las observaciones, ilustraciones y fotografías se realizaron con los microscopios Zeiss Standar 16, Zeiss SV 11 y un microscopio electrónico de barrido JEOL modelo JSM 6 480LL.
]]> ResultadosEsporas: En las cuatro especies estudiadas predominan las esporas triletes, triangulares, con cíngulo ecuatorial, perisporio translúcido y exosporio ornamentado con verrugas en la cara proximal y rugadas con procesos libres o unidos en la cara distal, excepto en P. ensiformis que tiene conos en ambas caras.
Además de las triletes, P. cretica (Fig. 1 A-C) y P. multifida (Fig. 1 D-F) presentan esporas atípicas, con varios tipos de aberturas y, por lo tanto, de formas variadas. Las esporas pueden ser monoletes, tetraletes e intermedias entre monoletes y triletes o entre triletes y tetraletes. Eventualmente se observaron esporas colapsadas. P. ensiformis (Fig. 1 G) y P. vittata (Fig. 1 H-I) tienen solo esporas triletes. En todos los taxones estudiados se presentan esporas translúcidas sin contenido celular y esporas pequeñas, generalmente colapsadas.
El estudio palinológico se resume en el Cuadro 1. ]]>
Desarrollo de los gametofitos: El desarrollo del gametófito comienza cuando la primera división ocurre en sentido paralelo al eje ecuatorial de la espora, originándose dos células desiguales: la más pequeña o proximal, en relación con las futuras divisiones, origina el primer rizoide y la distal o célula protálica origina al gametófito.
El primer rizoide contiene cloroplastos y elaioplastos durante las primeras horas de su crecimiento; luego, estos plástidos se reabsorben y el rizoide se torna incoloro.
La germinación comienza a los 3 días en P. vittata y a los 6-7 días en las otras especies (Fig. 2 A, 3 A). Después de 10 días de realizada la siembra, se observa que el porcentaje de germinación es del 97% para P. vittata, P. multifida (35%), P. ensiformis (30%) y P. cretica (25%).
El tiempo de germinación de las esporas monoletes, tetraletes e intermedias de P. cretica y P. multifida es semejante al requerido por las esporas triletes.
La germinación no es un proceso sincrónico; ocurre entre los 30-40 primeros días. Sólo las esporas hialinas y colapsadas permanecen sin cambios en el sustrato después de este tiempo.
El desarrollo de gametófitos filamentosos se origina inmediatamente después de la germinación y la dirección del crecimiento es paralela al eje polar de la espora.
Los filamentos son cortos con 3-5 células, en P. cretica, P. multifida y P. vittata (Fig. 2 B) o largos, con 7-9 células, en P. ensiformis (Fig. 3 B-C). En esta última especie también se observan células protálicas que permanecen indivisas un par de días, alcanzan la longitud de los protalos filamentosos (Fig. 3 D), luego se tabica y continúa su crecimiento como los otros. Los gametófitos filamentosos desarrollan 1-4 rizoides en las células próximas a la espora. ]]>
Este estado perdura 3-4 días; luego, en P. cretica y P. multifida, la célula distal y la anterior a ésta se dividen en sentido paralelo al eje del filamento y una división oblicua en la célula distal origina una célula meristemática central obcónica.
En P. ensiformis y P. vittata, la célula distal del filamento y las anteriores a ésta se dividen en sentido paralelo al eje del filamento sin diferenciación de una célula obcónica (Fig. 3 E).
Los gametófitos espatulados son cortos en P. cretica, P. multifida y P. vittata (Fig. 2 C-D) y largos en P. ensiformis.
La forma laminar se desarrolla a partir de los 10-14 días desde la siembra de las esporas (Fig. 2 E-F), salvo en P. vittata que comienza antes. P. cretica y P. multifida generan gametófitos laminares con una escotadura central donde la célula obcónica central origina un meristemo pluricelular (Fig. 2 G). P. ensiformis y P. vittata producen gametófitos laminares amerísticos, asimétricos (Fig. 2 H, 3 F-G) que desarrollan un meristemo pluricelular sobre un lado de la lámina; éste, paulatinamente, queda inserto en una escotadura. La asimetría de los gametófitos laminares de estas dos especies es diferente: P. vittata forma hemiláminas semejantes de distintas dimensiones (Fig. 2 J-K) y P. ensiformis origina formas irregulares con hemiláminas de morfología variable (Fig. 3 H-L).
]]> Independientemente del tipo de desarrollo gametofítico, a partir de los 14 días se encontraron gametófitos cordiformes con un área central pluriestratificada en las cuatro especies (Fig. 2 L, 3 M).Los gametófitos maduros, después de los 50 días, emiten en la base 1-3 filamentos, cada uno de los cuales crece y origina un nuevo gametófito laminar (Fig. 2 I). Los nuevos individuos alcanzan rápidamente la forma cordada y se disponen en forma centrípeta uno al lado del otro, sin superponerse. Este proceso se repite en todos los individuos, de manera que se generan colonias con 10 a 40 gametófitos (Fig. 2 M).
Gametangios: Los gametófitos de las cuatro especies son protándricos. P. cretica produce anteridios en la zona media de la lámina a partir de los 14 días; P. ensiformis, P. multifida y P. vittata desarrollan anteridios después de los 30 días, cuando los gametófitos alcanzan la forma cordada.
Los anteridios se ubican entre los rizoides o en zonas próximas a éstos. Son del tipo común de los helechos leptosporangiados y están formados por una célula basal, una célula anular y una célula opercular. Tienen forma ovada en P. cretica, P. ensiformis y P. multifida y son más o menos cilíndricos en P. vittata (Figs. 5 A-B).
El aspecto de los anteridios responde a la forma de la célula anular, que es la que predomina en este gametangio.
Los arquegonios se han encontrado a partir de los 40 días en P. ensiformis, P. multifida y P. vittata. Estos gametangios se ubican sobre el lado abaxial del área central, próximos a la escotadura de la lámina. Los cuellos de los arquegonios están formados por 4 hileras de 4 células cada una. P. cretica no desarrolló arquegonios.
Es frecuente que los gametófitos repicados durante un año formen costillas bifurcadas, gametangios en ambos lados del gametófito y sobre las hemiláminas. En P. multifida se han encontrado callos que se originan en el área central como masas blanquecinas que se extienden hasta reemplazar completamente al gametófito.
Esporófitos: Los esporófitos se evidencian a partir de los 3 meses. La primera evidencia de la formación de un embrión ocurre a partir de los 30 días con la aparición de un mamelón sobre la cara abaxial del área central, por debajo del cuello del gametófito (Fig. 4).
En P. cretica, esta protuberancia está cubierta por escamas clatradas y castañas, de la que emergen entre 2 y 5 circinos que se despliegan hacia el ápice (Fig. 6 E). Las restantes especies originan 1-2 esporófitos por cada gametófito (Fig. 6 A). En todos los casos, sólo uno de ellos se desarrolla.
La primera fronda que emerge tiene vernación circinada, lámina de contorno triangular, margen entero y venas libres; el pecíolo es translúcido, 6-8 veces más largo que la lámina y de sección circular. El indumento está representado por tricomas en toda la superficie de la lámina y el pecíolo. P. multifida tiene tricomas 4-6 celulares (Fig. 6 C) y las restantes especies 2-3 celulares (Fig. 6 B, D).
Aproximadamente a los 100 días, la lámina aumenta de tamaño y se forman dos o tres lóbulos con senos evidentes en las terminaciones de las venas; el margen se mantiene entero y la venación dicótoma, libre (Figs. 6 A, D; 7 A-B).
Cuando la lámina alcanza mayor tamaño, los segmentos se ensanchan y aumentan el número de lóbulos (Fig. 7 C); luego, el segmento apical se mantiene indiviso, su base es decurrente sobre el raquis y sus segmentos basales continúan dividiéndose (Figs. 7 G-H) hasta alcanzar la arquitectura de la lámina adulta. La venación dicótoma se mantiene, los tricomas se limitan al raquis y a las venas y el margen entero se transforma en aserrado (Figs. 7 D-F, 8). Las láminas son hipostomáticas con estomas polocíticos y las células epidérmicas de contorno sinuoso adquieren, paulatinamente, las ondulaciones del patrón adulto. A los 120 días, la fronda joven tiene la estructura de la planta adulta.
El estudio palinológico realizado en P. cretica, P. ensiformis, P. multifida y P. vittata muestra que estas especies comparten el predominio de esporas triletes y tienen un bajo porcentaje (entre 3 y17%) de esporas hialinas y colapsadas, coincidentes con la cantidad de esporas no germinadas en el medio de cultivo.
La morfología de las esporas atípicas (monoletes, tetraletes e intermedias) en P. cretica y P. multifida no influye en la viabilidad, por lo que estas esporas germinan en lapsos similares a las de P. ensiformis y otras especies de Pteris (Mendoza et al. 1997, Zhang et al. 2008 y Prada et al. 2008).
El tipo de germinación, en las cuatro especies, corresponde al tipo Vittaria según el criterio propuesto por Nayar & Kaur (1968). Este patrón de germinación es muy frecuente (Nayar & Kaur 1971) y ha sido mencionado para otras especies tales como P. berteroana (Mendoza et al. (1997), P. chilensis (Letelier & Peñailillo 2007), P. incompleta (Prada et al. 2008), P. finotti, P. fauriei, P. excelsa Gaudich., P. wallichiana (Zhang et al. 2008).
La célula rizoidal que emerge en la germinación, contiene plástidos en los primeros momentos de su crecimiento; ésta característica ha sido descrita también para P. fauriei (Zhang et al. 2008).
Las esporas de las cuatro especies germinan entre los 3 y 7 días después de la siembra mientras que otras especies del mismo género necesitan entre los 8 y 12 (Kawakami et al. 1995, Mendoza et al. 1997, Letelier & Peñailillo 2007). Esto ocurre, probablemente, porque las siembras se realizaron durante las dos primeras semanas desde su colecta, lo que evita cambios bioquímicos producidos por el almacenamiento (Beri & Bir 1993).
La capacidad de germinación se extiende hasta los 40 días, excepto en P. vittata donde se registra el 97% de germinación en los 10 primeros días de realizada la siembra, dato comparable al resultado logrado por Beri & Bir (1993) y Prada et al. (2008).
Los resultados de la morfogénesis indican que P. cretica, P. multifida y P. vittata tienen gametófitos filamentosos con 3-5 células, característica encontrada en P. berteroana, P. fauriei y P. wallichiana J. Agardh (Mendoza et al. 1997). Zhang et al. (2008) reportan gametófitos con 2 a 19 células para P. vittata y hasta 25 células para P. ensiformis en material proveniente de China. En el material de origen americano, esta última especie produce entre 7-9 células.
El desarrollo gametofítico de P. cretica y P. multifida corresponde al tipo Adiantum según la clasificación propuesta por Nayar & Kaur (1969). Dichos autores mencionan a este tipo como característico de Adiantum L., Cheilanthes Sw. y Doryopteris J. Sm., entre otros. Atkinson (1973) lo describe para P. tremula R. Br. y P. multifida.
Nayar & Kaur (1969) consideran que el tipo Ceratopteris es característico de Pteris y Atkinson (1973) lo encuentra en P. longifolia L., P. grandifolia L. y P. comans G. Forst. En este trabajo se encuentra que P. ensiformis y P. vittata responden a ese tipo de crecimiento. Las formas irregulares de los gametófitos laminares de Pteris ensiformis no se podrían asociar a la ploidía, por cuanto las cuatro especies estudiadas son poliploides (Walker 1962, Zhong-Ren 1989).
]]> El desarrollo de gametófitos monoicos protándricos en P. ensiformis, P. multifida y P. vittata favorece el cruzamiento en las especies con reproducción sexual, hecho considerado por Klenkowski (1969) como la forma más frecuente entre los helechos homospóricos.La estructura de los anteridios, en general, ha sido poco registrada mediante microscopía electrónica. Tanco et al. (2009) muestran anteridios de P. inermis donde se observan estos gametangios de aspecto ovoide semejantes a los encontrados en P. cretica, P. ensiformis y P. multifida. P. vittata tiene anteridios netamente cilíndricos; similar forma se observa en una fotografía presentada por Zhang et al. (2008) para esta especie.
En P. cretica es curiosa la aparición de anteridios en etapas muy tempranas del desarrollo gametofítico, pues esto indicaría la existencia de anteridiógenos (Raghavan 1989) que, en este caso, son innecesarios al no originarse arquegonios.
Los cuellos de los arquegonios en P. ensiformis, P. multifida y P. vittata tienen 16 células y son semejantes a los de P. cretica (Laird & Sheffield 1986) y P. inermis (Tanco et al. 2009). Zhang et al. (2008) menciona cuellos de arquegonios formados por 4 hileras con 3-5 células en cada anillo.
Previo al desarrollo de esporófitos se han registrado traqueidas en todas las especies estudiadas. Esta característica ha sido asociada inicialmente a la apogamia por Atkinson & Stokey (1964). En el material estudiado, P. cretica es apogámica debido a la formación únicamente de gametófitos anteridiados.
Según Walker (1962), P. cretica es una especie constantemente apogámica tanto en ejemplares diploides y triploides como en tetraploides (n=58 y 2n=c.120) y señala que es frecuente que las especies apogámicas produzcan arquegonios no funcionales, característica demostrada por Laird & Sheffield (1986) al determinar que las células del canal del cuello de los arquegonios colapsan, evitándose de esta manera el desplazamiento de los anterozoides a la ovocélula.
La formación de esporófitos apogámicos en P. cretica podría explicar su distribución cosmopolita, pues no depende de las condiciones ambientales propicias para una reproducción sexual.
Los esporófitos, provenientes tanto de reproducción sexual como apogámica, tienen el mismo patrón de desarrollo y alcanzan la estructura de las plantas adultas después de los 120 días de realizada la siembra.
Estos aportes provenientes de la morfogénesis de los gametófitos y esporófitos de P. cretica, P. ensiformis, P. multifida y P. vittata podrán ampliar las características taxonómicas del género Pteris y sus posibles relaciones con otros helechos, como lo sugieren Atkinson & Stokey (1964).
Agradecimientos
]]> Agradezco a Cristina Bonomo por facilitar equipamiento para este estudio, a María del Carmen Otero por el delineado de los dibujos con tinta china, a Pedro Villagrán por las atenciones durante el servicio de Microscopía Electrónica de Barrido, a Silvia Sastre por las correcciones del texto en inglés. A los revisores anónimos por las sugerencias brindadas para mejorar el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de la Universidad Nacional de Salta (Argentina) - Proyecto N°1585.Resumen
El género pantropical Pteris L. tiene 250 especies de la cuales 60 están en el continente Americano. Se estudió la morfogénesis de los gametófitos, y la morfología de los esporófitos jóvenes de cuatro especies: P. cretica, P. ensiformis, P. multifida y P.vittata, junto con un análisis palinológico que incluye la capacidad de las esporas de germinar. Los gametófitos se obtuvieron mediante técnicas de cultivo in vitro. Los esporófitos jóvenes se trasladaron a sustrato estéril de tierra y arena (3:1). Se usó el microscopio de luz y el de barrido (SEM). Se encontraron esporas con diferentes tipos de aperturas. La germinación ocurre entre 3-7 días y corresponde al tipo Vittaria. Se encontraron gametófitos filamentosos formados por 3-5 células en P. cretica, P. multifida y P. vittata y por 7-9 células en P. ensiformis. El desarrollo gametofítico ocurre de dos formas: tipo Adiantum y tipo Ceratopteris. Los gametófitos de P. ensiformis, P. multifida y P. vittata son monoicos y protándricos. P. cretica desarrolla gametófitos anteridiados. Los anteridios corresponden al tipo común de los helechos leptosporangiados, son cilíndricos en P. vittata y ovoides en las otras tres especies. Los cuellos de los arquegonios tienen 4 hileras con 4 células cada una. Los esporófitos se desarrollan después de los 3 meses de su siembra y su indumento es semejante a las plantas adultas. P. cretica presenta apogamia obligada.
Palabras claves: Pteris, esporas, desarrollo gametofítico, esporófitos jóvenes, apogamia.
Referencias
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