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Gina Bagnarello1; Luko Hilje2*; Vanessa Bagnarello3; Víctor Cartín4 & Marco Calvo1
1. Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA). Heredia, Costa Rica; ginabagnarello@yahoo.com
2. Departamento de Agricultura y Agroforestería, Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE). Turrialba, Costa Rica. Fax (506) 2558-2043; lhilje@catie.ac.cr
* Autor para correspondencia
3. Departamento de Investigación, Universidad de Ciencias Médicas (UCIMED). San José, Costa Rica.
4. Escuela de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional (UNA). Heredia, Costa Rica.
* Autor para correspondencia
Key words: Bemisia tabaci, whitefly, phagodeterrence, sesquiterpenic lactones, flavonoids, tannins, saponins, plant extracts.
La advertencia más formal, convincente y explícita acerca de la urgencia de conservar y aprovechar económicamente la biodiversidad tropical fue realizada hace dos decenios por Wilson (1988). Sin embargo, a pesar de contarse con numerosos organismos potencialmente útiles en la naturaleza tropical, es poco lo que se ha avanzado en el campo agrícola y, en particular, en su utilización en programas de manejo de plagas (Hilje & Hanson 1998).
Esto es de gran importancia para plagas como la mosca blanca Bemisia tabaci (Gennadius) (Homoptera: Aleyrodidae), que es cosmopolita y de gran importancia mundial, sobre todo como vector de virus muy destructivos en tomate, chile, frijol, soya, yuca y melón, tanto en regiones tropicales como subtropicales (Anderson & Morales 2005).
Aunque es un insecto muy polífago, que se puede desarrollar o reproducir en más de 500 especies, pertenecientes a 74 familias (Greathead 1986), se ha demostrado que puede ser afectada por numerosos principios de origen vegetal presentes en 17 familias (Hilje & Mora 2006). Curiosamente, aunque la familia Asteraceae contiene muchos representantes que son importantes hospedantes suyos (Greathead 1986), se ha demostrado que el extracto crudo de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray causa fagodisuasión en los adultos de B. tabaci (Aguiar et al. 2003).
Sin embargo, subsiste la interrogante de cuáles grupos de metabolitos secundarios provocan dicho efecto. Esto podría ser importante desde el punto de vista industrial, en cuanto a la eventual posibilidad de manufacturar productos derivados de dicha planta o de utilizar algunas moléculas clave como pistas para la síntesis química (Hall & Menn 1999). Asimismo, convendría evaluar otras plantas de la misma familia que sean nativas de Mesoamérica y suficientemente abundantes, como para contar con suficiente materia prima para la industria.
Por tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad biológica de T. diversifolia y de Montanoa hibiscifolia Benth. Sobre adultos de B. tabaci, con énfasis en la actividad fagodisuasiva de las particiones químicas de ambas especies y tratar así de identificar los posibles grupos de metabolitos que causan dicho efecto.
Materiales y métodos
Localización: Los experimentos entomológicos se efectuaron en un invernadero del Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), en Turrialba, en la vertiente Caribe de Costa Rica, a 9°52’N, 83°38’W y 640msnm, con promedios anuales de 22ºC, 2479mm de precipitación y 87% HR. Por su parte, la investigación química se realizó en el Laboratorio de Investigación y Tecnología Química (LIDETEQ), ubicado en la Escuela de Química de la Universidad Nacional.
La parte de la planta usada para esta investigación es únicamente el follaje para cada una de las plantas, la T. diversifolia fue recolectada el mes de setiembre del año 2005 en San Juan Sur, Turrialba (en los predios del CATIE) (9°53’N, 83°39’W,) y el de M. hibiscifolia se recolectó en setiembre del año 2005, en el INBioparque, en Santo Domingo, Heredia en la plantación ubicada por la laguna (9°58’N, 84°05’W).
]]> Extractos evaluados: El follaje de cada especie se secó en un horno de convección a 40°C durante una semana, tras lo cual se realizó su molienda, con un tamiz de 3mm. Se tomó una muestra de 300g de cada una y se maceró en etanol al 70% durante una semana, a 4°C. Cada extracto hidroalcohólico fue filtrado al vacío con papel Whatman No. 4, y concentrado a presión reducida en un evaporador rotatorio. Cada extracto crudo se fraccionó con disolventes de polaridad creciente (hexano, diclorometano, acetato de etilo y metanol). Después de separadas las fracciones, los extractos se concentraron a sequedad.Tratamientos y diseño experimental
Con cada especie vegetal se efectuaron dos tipos de experimentos, uno de escogencia restringida (planta tratada con una sola concentración vs. testigo, en un espacio cerrado) y otro de escogencia irrestricta (plantas tratadas con varias concentraciones vs. testigos, en un espacio abierto). En ambos casos se utilizó un diseño experimental de bloques completos al azar y la unidad experimental correspondió a cada planta que recibió el tratamiento respectivo.
Escogencia restringida: Los adultos de B. tabaci (biotipo A) se expusieron a una planta de tomate tratada (con el extracto o las fracciones) versus el testigo absoluto. Ambos extractos se aplicaron en cuatro dosis: 0.1, 0.5, 1.0 y 1.5 (% v/v). Se efectuaron experimentos individuales y se compararon con cuatro tratamientos testigo: aceite agrícola (1.5% v/v) (81 SC; Mobil Oil Corp., Memphis, Tennessee) (testigo relativo); endosulfán (Thiodan 35; Bayer CropScience, Argentina) como testigo químico (insecticida organoclorado), a la dosis recomendada comercialmente (2.5 mL/L de agua); Citowett (0.025% v/v) (BASF, Alemania) como agente tensoactivo; y agua destilada (testigo absoluto). En todos los tratamientos, las sustancias se mezclaron con el Citowett, para mejorar su adherencia al follaje.
Escogencia irrestricta: Para este experimento se escogieron las dosis más altas (1.0 y 1.5%) de cada extracto crudo. Se realizó en el invernadero, en macetas descubiertas, para exponer las plantas a la colonia de B. tabaci ahí presente. Las macetas, cada una con una planta de tomate, se colocaron sobre una mesa rodeada por plantas de berenjena infestadas por ninfas y adultos del insecto.
Plantas y aspersión: Los extractos se aplicaron a plantas de tomate con tres hojas, con ayuda de un atomizador DeVilbiss 15, de punta ajustable, conectado a una bomba de vacío (Cubillo & Hilje 1996), con una presión constante de 10kg/cm2. Las plantas de cada tratamiento se asperjaron en forma separada, con 30mL para cada una de las cuatro dosis; se rociaron por el envés y el haz del follaje.
Manipulación de los insectos: Se capturaron 50 adultos de B. tabaci, de edad desconocida y sin sexar, con un succionador manual, de una colonia criada en plantas de tomate y berenjena, en un invernadero del CATIE.
Variables de respuesta: En los experimentos de escogencia restringida, para determinar la fagodisuasión se utilizó como criterio la cantidad de adultos posados sobre cada una de las dos plantas (tratada vs. testigo) después de 48h; se contaron entre las 10-12h, cuando la actividad del insecto es menor (Jovel et al. 2000). El criterio para la oviposición fue el número de huevos depositados en cada planta de tomate hasta las 48h, utilizando un estereoscopio. La mortalidad se determinó contando el número total de adultos vivos dentro de cada jaula, tras verificar que los demás habían muerto, después de 48h; la comparación se hizo entre jaulas, independientemente de la planta donde estuvieran posados los adultos.
En el experimento de escogencia irrestricta se registró el número de adultos posados en las hojas asperjadas 1, 2, 8 y 15 días después de aplicado cada tratamiento. El número de ninfas grandes (ínstares I y II) se contó a los 15 días, en una cuadrícula de 1cm2 de una de las hojas.
Todos los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA). Las medias de cada tratamiento se compararon mediante la prueba de Duncan, con un nivel de significancia de 0.05%, utilizando el paquete estadístico SAS (SAS 1985).
]]> Estudio fitoquímico: Se realizó un tamizado para determinar los metabolitos secundarios que contiene la totalidad de la planta de cada especie (Sharaipin et al. 2000). Al extracto se le realizaron diferentes ensayos con reacciones químicas de identificación, mediante cambios de color o formación de precipitados. Asimismo, se realizó cromatografía de capa fina (CCF) mediante una fase absorbente (FS) de gel de sílice Merck 60F245, utilizando diferentes fases móviles (FM). Se identificaron los compuestos químicos mayoritarios mediante cromatografía de gases (CG) y espectrometría de masas (MS), para lo cual se empleó un cromatógrafo Hewlett Packard serie 6890 acoplado con masas.Se analizaron las fracciones más promisorias de ambas plantas. La separación cromatográfica se realizó usando una columna capilar Heliflex AT-1 (30mx0.32mmx0.3μm) Alltech, utilizando helio como gas de arrastre. La temperatura inicial fue de 150°C y la mαxima de 325°C, con un tiempo inicial de 3min y un gradiente de 4°C por min; el tiempo total de corrida fue de 66min, a una presión de 13.28psi. Los compuestos fueron identificados mediante los datos del impacto electrónico de su masa espectral, el orden de elusión y el tiempo de retención relativo por CG, complementados con la comparación de su masa espectral y los tiempos de retención por CG con compuestos conocidos, mediante el paquete de cómputo que se encuentra integrado al equipo.
Resultados
Escogencia restringida: Debido a la naturaleza de los experimentos, las comparaciones correspondientes a la fagodisuasión y la respuesta de oviposición son válidas solamente entre tratamientos dentro de una misma jaula, y no entre jaulas. Sin embargo, para la mortalidad, las comparaciones sí son válidas entre jaulas.
En cuanto al extracto crudo de T. diversifolia, las plantas tratadas con las dos dosis mayores tuvieron menos adultos posados (p<0.05) (Fig. 1A), y a esas dosis también hubo menor oviposición (p<0.05) (Fig. 1B). Se observó una tendencia análoga a la del aceite agrícola. En relación con la mortalidad, ninguna de las dosis mostró diferencias con el testigo absoluto, aunque sí con el endosulfán, y tampoco difirieron (p> 0.05) del aceite agrícola (Fig. 1C).
Por su parte, con el extracto crudo de M. hibiscifolia con las cuatro dosis hubo menos adultos posados (p<0.05), de manera análoga al aceite agrícola (Fig. 2A) y con todas hubo menor oviposición (p<0.05), excepto al 0.5% (Fig. 2B). En cuanto a la mortalidad, no hubo diferencias (p>0.05) entre las dosis aplicadas; además, ninguna de ellas ni el aceite agrícola mostraron diferencias con el testigo absoluto (p>0.05), pero sí con el endosulfán (Fig. 2C).
En relación con las fracciones de T. diversifolia, la única que no causó fagodisuasión fue la de acetato de etilo (Fig. 3A). Con la de hexano hubo menos adultos posados (p<0.05) al 0.5%, sin que esa tendencia se mantuviera o incrementara a dosis mayores (Fig. 3B), mientras que con la de diclorometano sucedió algo parecido, pero con menos adultos posados (p<0.05) al 0.1% (Fig. 3C). Finalmente, con la fracción de metanol hubo menos adultos posados (p<0.05) a las dos dosis mayores (1.0 y 1.5%) (Fig. 3D). Con estas tres fracciones, la oviposición en general mantuvo las mismas tendencias de la fagodisuasión, mientras que en la mortalidad ninguna dosis ni el aceite agrícola difirieron del testigo absoluto, aunque sí marcadamente (p<0.05) del endosulfán.
En cuanto a las fracciones de M. hibiscifolia, las de acetato de etilo, hexano y diclorometano no causaron fagodisuasión, como sí lo hizo el aceite agrícola (Fig. 4A-C). En cambio, las plantas tratadas con la fracción de metanol tuvieron menos adultos posados (p<0.05) en dos dosis, que no fueron continuas, 0.1 y 1.0% (v/v) (Fig. 4D). La oviposición en general mostró las mismas tendencias de la fagodisuasión, mientras que en la mortalidad ninguna dosis ni el aceite agrícola difirieron del testigo absoluto, aunque sí fuertemente (p<0.05) del endosulfán.
Escogencia irrestricta: Por la naturaleza del experimento, las comparaciones correspondientes a la fagodisuasión y el desarrollo ninfal son válidas entre tratamientos (a diferencia de los de escogencia restringida), pues todos ellos estuvieron igualmente expuestos al mismo grupo de adultos de B. tabaci presente en el invernadero. En dicho experimento se compararon las dosis más promisorias de los extractos crudos de cada una de las plantas.
En el primer recuento, a las 24h de asperjados los extractos, hubo tres grupos de tratamientos, con los extremos ocupados por el testigo absoluto y el aceite agrícola, y todas las dosis de titonia y tora ocupando una posición intermedia, sin diferir (p>0.05) del aceite agrícola, excepto la de tora al 1% (Fig. 5A). A las 48h, el número de adultos posados aumentó en todos los tratamientos, y las diferencias entre el testigo relativo y el absoluto se acentuaron mucho, mientras que ninguna de las dosis de los extractos difirió del testigo absoluto (Fig. 5B). Todas las diferencias se desvanecieron posteriormente (Fig. 5C-D). En cuanto a las ninfas, no hubo diferencias entre los tratamientos.
Asimismo, el análisis de las fracciones promisorias reveló la presencia de triterpenos y esteroides en la de hexano; de lactonas sesquiterpénicas, triterpenos, esteroides, glicósidos cardiotónicos y cumarinas en la de diclorometano; y de compuestos polifenólicos (flavonoides y taninos), lactonas sesquiterpénicas y saponinas en la fracción de metanol (Cuadro 3).
Por su parte, el tamizado de M. hibiscifolia reveló la presencia de triterpenos y esteroides en los extractos etéreo y alcohólico, así como de compuestos reductores y polifenólicos en los extractos alcohólico y acuoso, y de saponinas en el acuoso (Cuadro 2). Además, en la fracción de metanol se detectaron compuestos polifenólicos (taninos), lactonas sesquiterpénicas y saponinas (Cuadro 3). ]]>
Discusión
En los extractos crudos del follaje de T. diversifolia y de M. hibiscifolia hay principios químicos que causan fagodisuasión en los adultos de B. tabaci, lo cual corrobora los hallazgos de Aguiar et al. (2003) para la primera especie. Hay abundante información acerca de la capacidad de este insecto para responder a este tipo de sustancias, la cual ha sido compilada por Hilje & Mora (2006). Es posible que los adultos de B. tabaci discriminen al frotar el follaje de la planta con la punta del labio, donde poseen setas sensoriales pequeñas, cuya ultraestructura sugiere que son quimiorreceptores, o químicos y mecánicos a la vez, es decir, mecano-quimiorreceptores (Walker & Gordh 1989).
La fagodisuasión detectada se sustenta en que hubo mucho menos adultos en las plantas tratadas con ciertas dosis de ambos extractos crudos, asemejándose a lo ocurrido con el aceite agrícola, que actúa como un fagodisuasivo táctil, supuestamente (Larew & Locke 1990) y cuyo efecto sobre B. tabaci ha sido ampliamente demostrado (Hilje & Mora 2006). Además, su mortalidad fue casi despreciable, en contraste con la causada por el endosulfán, insecticida de eficacia comprobada contra dicho insecto (Hilje & Mora 2006); en este último tratamiento, tarde o temprano los adultos depositados en la jaula entraron en contacto con la planta tratada con el endosulfán, resultando muertos.
Sin embargo, estos resultados no se reflejaron de manera clara al evaluarse las particiones o fracciones de cada especie vegetal. Para T. diversifolia se detectó fagodisuasión con las fracciones de hexano, diclorometano y metanol, y para M. hibiscifolia solamente con la de metanol. Pero aún en estos casos las tendencias no fueron tan constantes y definidas. Esto quizás podría explicarse por la sinergia necesaria entre varios de sus componentes para que se exprese la fagodisuasión, como lo han sugerido otras investigaciones (Flores et al. 2008). Al respecto, Warthen & Morgan (1990) indican que cuando los compuestos puros se estudian de manera individual, a la misma concentración en que aparecen en las plantas, son menos activos que en la planta en sí, pero cuando se combinan puede haber un efecto multiplicativo, que produce una disuasión comparable al efecto causado por la planta misma.
Fue por esta razón que para los experimentos de escogencia irrestricta, los cuales se asemejan más a las condiciones de producción de tomate en ambientes protegidos, no se eligió ninguna de las fracciones, sino los extractos crudos de ambas especies. Sin embargo, no se cumplieron las expectativas, pues su efecto no superó las 48h, lo que revela la baja persistencia de los principios fagodisuasivos presentes en los extractos, sobre todo bajo las altas temperaturas que comúnmente se alcanzan en los invernaderos, a veces de 38-40ºC.
Acerca de la identidad de dichos principios fagodisuasivos, en ambas especies vegetales el extracto con mayor actividad fue el de metanol, por lo que los metabolitos secundarios pertenecen a las mismas familias químicas.
Se corroboraron los hallazgos de otros autores, como la presencia en T. diversifolia de ácidos grasos en el extracto etéreo (Moronkola et al. 2006), y de saponinas y taninos condensados en el extracto acuoso (Tona et al. 1998), al igual que de la hispidulina, que es un flavonoides (Baruah et al. 1994). Además, hubo lactonas sesquiterpénicas en abundancia. También, en la fracción de diclorometano se detectó el espatulenol, que es un sesquiterpeno presente Artemisia herba-alba y A. monosperma (Asteraceae) con fuerte actividad insecticida (85% de mortalidad) sobre B. tabaci (Mahmoud & Soliman 2007). Dichos autores también identificaron varios terpenos y sesquiterpenos en aceites esenciales extraídos de Artemisia herba-alba y A. monosperma y que, evaluados en condiciones de laboratorio sobre B. tabaci, demostraron causar un efecto disuasivo sobre este insecto.
Por su parte, para M. hibiscifolia se confirmó la presencia de lactonas sesquiterpénicas en el extracto de diclorometano y metanol (Müller et al. 2004), así como de tres triterpenos (acetato de β-amirina, palmitato de β-amirina y ácido caurenoico) en el extracto de hexano (Calvo 1984).
Además, tanto T. diversifolia como M. hibiscifolia poseen taninos, cuyo efecto tóxico sobre los adultos de B. tabaci fue demostrado por Cavalcante et al. (2006). Dichos autores determinaron que de cuatro especies de plantas evaluadas (Prosopis juliflora, Myracrodruon urundeuva, Leucaena leucocephala y Mimosa caesalpiniifolia), las que causaron mayor mortalidad fueron aquellas con mayor concentración de taninos. Estas son sustancias cuantitativas, por actuar como reductores digestivos, con un efecto proporcional a su concentración (Strong et al. 1984); reducen significativamente el crecimiento y la supervivencia de insectos, al inactivar las enzimas digestivas y generar un complejo de tanino-proteína de difícil digestión (Mello & Silva-Filho 2002).
]]> En realidad, los metabolitos secundarios encontrados en mayor proporción en T. diversifolia y M. hibiscifolia corresponden a las lactonas sesquiterpénicas, que son principios amargos, los cuales quizás sean percibidos como tales por los receptores del insecto (Walker & Gordh 1989), y podría explicar el efecto fagodisuasivo observado. Por su parte, las saponinas, que están presentes en ambas especies, pueden reducir la oviposición en las hembras de B. tabaci, como lo determinaron Bouchelta et al. (2005) al analizar las saponinas presentes en el chile dulce (Capsicum frutescens) dichas sustancias actúan inhibiendo el desarrollo del insecto.En síntesis, está pendiente aún la identificación y caracterización de los principios fagodisuasivos específicos presentes en ambas especies vegetales y, una vez hecho esto, convendría evaluarlos solos y en combinaciones, para determinar la importancia de la sinergia, con miras al desarrollo de un producto comercial. De lograrse esto eventualmente, una ventaja con ambas especies es su disponibilidad, pues son plantas silvestres que quizás podrían domesticarse con facilidad, y de las que se podrían aprovechar otras características ventajosas, especialmente desde el punto de vista farmacológico.
Por ejemplo, T. diversifolia es originaria de Mesoamérica (Obafemi et al. 2006, Ogundare 2007) y se distribuye desde México hasta Costa Rica. Se encuentra en sitios abiertos, a elevaciones intermedias, con clima de húmedo a muy húmedo (Holdridge & Poveda 1975). Además de sus propiedades medicinales para el tratamiento de la diarrea, fiebre, hematomas, hepatitis, malaria y diabetes (Gu et al. 2002, Miura et al. 2002), así como antiproliferativas (Ziémons et al. 2007), tiene valor como abono verde, dados los altos contenidos foliares de nitrógeno, fósforo, calcio y potasio, por lo que tiene gran potencial en sistemas agroforestales (Kass 1999, Jorge 2005, Phan Thi & Merckx 2005); esto explica que se utilice ampliamente en Asia y África, en barbechos mejorados.
Por su parte, M. hibiscifolia también es nativa de Mesoamérica y se distribuye desde Guatemala hasta Costa Rica (Müller et al. 2004). Es común en bosques, orillas de caminos y pastizales, a elevaciones intermedias, con clima de húmedo a muy húmedo (Holdridge y Poveda 1975). Las lactonas sesquiterpénicas que contiene poseen actividad antiinflamatoria (Müller et al. 2004).
No obstante el valor medicinal de ambas especies, para el eventual desarrollo de un producto semi-rústico o industrial, los productos candidatos oportunamente deberían evaluarse en cuanto a sus efectos sobre las personas y la fauna silvestre y, de superarse estas etapas, convertirse en una opción que podría incorporar valor agregado a un recurso poco utilizado de la abundante biodiversidad tropical.
Agradecimientos
A Arturo Ramírez (CATIE), por su apoyo en los experimentos de invernadero. A las autoridades del Departamento de Agricultura y Agroforestería del CATIE y de la Escuela de Química de la UNA, por permitir la realización de los experimentos en sus instalaciones.
Resumen
Bemisia tabaci (Gennadius) (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polífaga, cosmopolita y de gran relevancia mundial, sobre todo como vector de virus en numerosos cultivos, por lo que sería deseable un enfoque preventivo para su manejo. En tal sentido, podría recurrirse a la utilización de sustancias repelentes o disuasivas, algunas de ellas presentes en plantas tropicales, lo cual contribuiría al aprovechamiento de la rica biodiversidad mesoamericana. Por tanto, se evaluó la posible actividad fagodisuasiva sobre los adultos de B. tabaci de dos especies silvestres de la familia Asteraceae: titonia (Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray) y tora (Montanoa hibiscifolia Benth.). Para ello, en condiciones de invernadero se evaluaron los extractos crudos y cuatro fracciones (hexano, diclorometano, acetato de etilo y metanol) de ambas especies, a los cuales se les hizo un análisis fitoquímico (tamizaje) el cual permitió determinar cuáles metabolitos presentes en T. diversifolia y M. hibiscifolia podrían causar fagodisuasión en B. tabaci. Se realizaron dos tipos de experimentos: de escogencia restringida y de escogencia irrestricta. En los primeros, cada fracción se evaluó a cuatro dosis (0.1, 0.5, 1.0 y 1.5% v/v), y se comparó con cuatro tratamientos testigo: aceite agrícola, endosulfán, un emulsificante (Citowett) y un testigo absoluto (agua). Se asperjaron plantas de tomate colocadas dentro de jaulas de manga, donde se liberaron 50 adultos de B. tabaci. Para determinar si existía fagodisuasión se utilizó como criterio el número de adultos posados a las 48h. Para el experimento de escogencia irrestricta se utilizaron las dos concentraciones más altas (1.0 y 1.5%) del extracto crudo de cada especie y se compararon con el aceite agrícola y agua. Los extractos crudos de titonia y tora causaron fagodisuasión, y para ambas especies la fracción de metanol fue la que más sobresalió. En conclusión, los resultados obtenidos en los bioensayos junto con los obtenidos en el análisis de los componentes químicos presentes, sugieren que los metabolitos causantes de la fagodisuasión son algunas lactonas sesquiterpénicas, compuestos polifenólicos (flavonoides y taninos) y saponinas.
Palabras clave: Bemisia tabaci, mosca blanca, fagodisuasión, lactonas sesquiterpénicas, flavonoides, taninos, saponinas, extractos vegetales. ]]>
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