Variabilidad genética en géneros de ciervos neotropicales (Mammalia: Cervidae) según loci microsatelitales
Manuel Ruiz-García1*, María Martinez-Agüero1, Diana Álvarez1 & Simon Goodman2
1. Unidad de Genética (Genética de Poblaciones-Biología Evolutiva), Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Cra 7A No 43-82, Bogotá DC. Colombia; mruiz@javeriana.edu.co; mruizgar@yahoo.es
2. Institute of Cell, Animal and Population Biology, University of Edinburgh, United Kingdom.
* Correspondence
Abstract: Genetic variability in Neotropical deer genera (Mammalia: Cervidae) according to DNA microsatellite loci. Species conservation programs are highly based on analyses of population genetics. We compared eight Neotropical Cervidae (Mazama americana, M. gouzaoubira, M. rufina, Odocoileus virginianus, Hippocamelus antisensis, Pudu mephistopholes, Ozotoceros bezoarticus and Blastoceros dichotomus) and some European and Asian Cervidae (Cervus elaphus, C. nippon, Capreolus capreolus, C. pygargus and Dama dama). The European species C. elaphus was our standard for a high degree of genetic variability: we used a Scottish population originated in the mix of diverse Western European subspecies. On the contrary, Cervus nippon (a population from Scotland with a founder effect) was our standard for a depauperated population. The M. americana, M. gouzaoubira and O. virginianus samples had high diversity values close to our C. elaphus population (H= 0.64, 0.70 and 0.61, respectively), while M. rufina was very low, close to C. nippon. Several sample sets of Mazama and Odocoileus yielded a homozygote excess, probably due to the Wahlund (subdivison) effect. There was no evidence of recent bottleneck events. Rev. Biol. Trop. 57 (3): 879-904. Epub 2009 September 30.
Key words: Neotropical Cervidae, Mazama, Odocoileus, DNA microsatellites, population genetics.
El presente estudio, complementario al de Ruiz-García et al. (2007), se fundamenta en la determinación y comparación de los niveles de diversidad génica entre diversas especies de cérvidos europeos y asiáticos. Este es el primer estudio donde se reportan niveles de diversidad genética en cérvidos neotropicales mediante marcadores microsatélites hipervariables. Por eso, únicamente se pueden efectuar comparaciones con algunas especies pertenecen a de ciervos europeos y asiáticos ya que son los únicos cérvidos que han sido estudiados desde la misma perspectiva molecular (ver Goodman et al. 2001).
En el ámbito de la genética conservacionista se asume que cuanto menor sea el tamaño efectivo de una población, menor será, también, la diversidad genética de la misma de cérvidos neotropicales respecto a algunas y, por ende, tendrá menores posibilidades de especies poder responder adaptativamente ante cualquier tipo de cambio ambiental (Ruiz-Garcia 2001). Para llevar a cabo esta tarea, se obtuvieron 71 muestras de ciervos neotropicales. Las muestras provienen de diferentes regiones geográficas de Latinoamérica y ocho especies diferentes de los tres grupos tradicionalmente establecidos. Estas especies son: Odocoileus virginianus, Ozotoceros bezoarticus y Blastocerus dichotomus (alto porte, cuernos ramificados), Hippocamelus antisensis (mediano porte, cuernos bifurcados), Mazama americana, Mazama gouazoubira, Mazama rufina, y Pudu mephistopheles (pequeño porte, cuernos no ramificados). Adicionalmente, y como punto de comparación, se reunieron muestras de Cervus elaphus (ciervo rojo europeo) de una población escocesa (Gran Bretaña) proveniente, de múltiples reintroducciones de estos ciervos a partir de diversas áreas de la Europa continental. Esta especie presenta multitud de poblaciones y subespecies, en Europa, que han sido reconocidas como diferentes a partir de estudios morfológicos, bioquímicos y moleculares. Whitehead (1972) reconoció 23 subespecies de Cervus elaphus. Hartl et al. (1995) estudiaron el ADN mitocondrial de Cervus elaphus procedentes de 15 localidades distribuidas por el centro, occidente y sur-este de Europa y descubrieron nueve haplotipos mitocondriales diferentes. La relación entre esos haplotipos fue consistente con la distribución geográfica de las diversas poblaciones analizadas. La distribución geográfica de los haplotipos de los tres linajes principales se corresponden con diversas subespecies morfológicas propuestas por Groves & Grubb (1987). Lowe & Gardiner (1974), únicamente reconocieron C. e. elaphus como la única subespecie del norte de Europa en virtud de sus análisis craneométricos. El linaje europeo oriental podría corresponder a la subespecie morfológica C. e. montanus, mientras que el linaje sur-oriental podría corresponder a C. e. maral. Eso nos induce a pensar que la variabilidad genética de las muestras obtenidas en Escocia debería ser muy elevada, ya que podrían representar individuos híbridos de esas diversas subespecies de ciervo rojo en Europa. Por lo tanto, los resultados de esa muestra pueden representar un límite superior en cuanto al nivel de heterocigosis (=diversidad genética) que se encuentran en las poblaciones de cérvidos. También se analizaron muestras de Cervus nippon (sika) procedentes de Escocia. Esta es una especie de origen asiático que se introdujo, por primera vez, en Gran Bretaña en 1860 (Powerscourt 1884), con posteriores reintroducciones hasta, aproximadamente, 1930 (Goodman et al. 2000). Las muestras obtenidas provienen de una población pequeña que pudo sufrir un intenso efecto fundador con la consiguiente pérdida de variabilidad genética (Emmerson & Tate 1993). Igualmente, Goodman et al. (2001) determinaron la heterocigosis de diversas poblaciones de Cervus nippon en Japón y de poblaciones introducidas en Escocia. Las poblaciones japonesas en las zonas más fragmentadas, como Nagasaki (H=0.19) y Tanegashima (H=0.21), presentaron niveles de variabilidad genética inferiores al de las poblaciones con hábitats amplios, tales como Iwate (H=0.49), Kinkazan (H=0.54), Shimane (H=0.45) y Hyogo (H=0.60). Las cuatro poblaciones de C. nippon introducidas en Escocia e Inglaterra presentaron niveles reducidos de heterocigosis (Argyll, H=0.13; Fife, H=0.27; Peebles, H=0.38 y Dorset, H=0.21) mostrando evidente depauperación genética por efecto fundador. La pregunta central que nos formulamos en el presente trabajo es la siguiente. ¿Están los niveles de variabilidad genética en diversas especies de cérvidos neotropicales más cercanos a los altos valores esperados del Cervus elaphus en Escocia, probablemente resultado del cruzamiento entre individuos representativos de diversas subespecies?. O, por el contrario, ¿están más cercanos a los niveles reducidos de diversidad génica del Cervus nippon introducido en Gran Bretaña?. Esto es, el nivel reducido de variabilidad genética de C. nippon en las poblaciones japonesas pequeñas, y en las introducidas en Gran Bretaña, puede mostrar un límite inferior, denotando un estado de variabilidad genética pobre para las poblaciones de ciervos neotropicales que estén cercanas a esos valores. Por el contrario, las poblaciones de cérvidos neotropicales que posean niveles de variabilidad genética similares al C. elaphus escocés (H=0.71) pueden considerarse como poseedoras de una diversidad genética elevada. Esos son los niveles de variabilidad genética más reducidos y más elevados que se han encontrado en cérvidos utilizando marcadores microsatélites idénticos a los que se emplearon en el presente estudio. Adicionalmente para tener una perspectiva más amplia de la citada cuestión, se consiguieron muestras de ADN de otros cérvidos europeos: C. elaphus de origen italiano, Capreolus capreolus (corzo) procedentes de España y de Italia, y Dama dama (gamo) procedentes, también, de España y de Italia. De forma comparativa, se analizaron algunas muestras del rebeco catalán (Rupycapra pyrenaica), un bóvido silvestre.
Para ello, se aplicaron 16 marcadores hipervariables microsatélites (STRP; Short Tandem Repeat Polimorphisms) diseñados para diferentes especies. Diez de ellos fueron diseñados para bóvidos y están altamente conservados en otros Artiodactyla, como los Cervidae y los Caprinae (Slate et al. 1998). Otros autores (Engel et al. 1996) han mostrado, también, que otro conjunto de 12 microsatélites elaborados para bovinos, siete para caprinos y un par específico de ovinos, son útiles para su aplicación en cérvidos.
También, a partir de los resultados moleculares obtenidos, se realizaron diferentes análisis poblacionales. Entre ellos la estimación de la heterogeneidad genética entre poblaciones de una misma especie y la determinación de posibles cuellos de botella recientes en algunas de las especies analizadas.
Materiales y métodos
Análisis molecular: Las especies de cérvidos neotropicales y el número total de ejemplares analizados fueron: 22 muestras de Mazama americana, ocho muestras de Mazama gouazoubira, dos muestras de Mazama rufina, 23 muestras de Odocoileus virginianus, cuatro muestras de Hippocamelus antisensis, dos muestras de Pudu mephistopheles, dos muestras de Ozotoceros bezoarticus, ocho muestras de Blastocerus dichotomus, sumando un número total de 71 individuos. Para las especies euro-peas y de origen asiático, se estudiaron nueve ejemplares de Cervus elaphus y cinco de Cervus nippon, 26 ejemplares de Capreolus capreolus, cinco ejemplares de Dama dama, más cuatro ejemplares de Capreolus pygargus, sumando un total de 49 ejemplares. Comparativamente, se procesaron, también, muestras de cuatro Rupicapra pyrenaica (Rebeco, Bovidae) procedentes de los Pirineos Catalanes. La descripción del origen de los ejemplares analizados y el tipo empleado de muestra de los cérvidos neotropicales estudiados se encuentra en el Cuadro 1. Para la interpretación de los análisis se consideró dos especies Europeas como referencias: la especie Cervus elaphus (de Escocia), tomada como un grupo de alta variabilidad genética por su origen en una mezcla de diversas subspecies de Cervus elaphus de Europa Occidental; y la población de Cervus nippon en Escocia, como representante de una población completamente empobrecida por constituirse a través de un evento fundador.
Los marcadores microsatélites empleados fueron: (1) diseñados para bóvidos, RM012, BM757, INRA131, IDvGA055, FCB193, TGLA337, HUJ175, BOvIRBP, TGLA127 y FSHB (Slate et al. 1998), (2) diseñados para el ciervo coli-blanco (Odocoileus), Cervid 1 y Cervid 3 (Dewoody et al. 1995) y (3) diseñados para reno, Rangifer tarandus, NvHRT 16, NvHRT 30, NvHRT 71 y NvHRT 73 (Roed & Midthjell 1998). Esto significa que para el estudio de la estructura y la diversidad genética de poblaciones y especies de cérvidos, al igual que para otros grupos, existe un éxito significativo en el uso de cebadores ("primers") heterólogos para la PCR en la amplificación de loci microsatélites, eliminando esto, la estricta necesidad de desarrollar nuevos conjuntos de cebadores para cada especie determinada.
En el Anexo I se muestran los alelos encontrados, previamente, en C. elaphus y C. nippon para los marcadores microsatélites de bóvidos, al igual que el rango de tamaños alélicos presentados por los mismos y las temperaturas de anillamiento ("anealling") para cada marcador. Para obtener los correspondientes genotipos se procedió del siguiente modo. Una vez que el ADN fue obtenido a partir de dos procedimientos diferentes (Fenol-Cloroformo y resina Chelex), se llevaron a cabo reacciones de PCR en un volumen de 25 µl, cuando el ADN fue extraído de tejido o sangre, con 2.5 µl de MgCl2 2.5 µM, 2.5 µl de Buffer 10x, 1 µl dNTPs 1 mM, 1 µl de ambos cebadores ("forward" y "reverse") (4pmol), 14 µl de H2O, 0.25 unidades de Taq polimerasa (1u/µl) y 2 µl de ADN. Cuando el ADN fue extraído de raíz de pelo, el volumen de la reacción de PCR fue de 5 µl. En este caso, se agregaron 20 µl de AND y el doble de las cantidades de reactivos anotadas en el caso anterior. La reacción se llevó a cabo en un termociclador Geneamp PCR System 9600 de Pekin Elmer. Las temperaturas utilizadas para los marcadores de bóvidos fueron 2 min a 94ºC, seguidas de 7 ciclos de 30 s a 94ºC, 1 min a 50ºC y 30 s a 72ºC y de 30 ciclos a 94ºC, 1 min 50ºC y 30 s a 72ºC de extensión. Para los de cuervo coli-blanco fueron 2 min a 94ºC, seguidas de 35 ciclos de 30 s a 92ºC, 1 min a 60ºC y 2 min a 74ºC y 10 min a 74ºC de extensión. Para los marcadores de reno, las temperaturas fueron: 5 min a 94 oC, seguidas de 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 30 s a 55ºC y 1 min a 72ºC de extensión. Los productos de amplificación se almacenaron a 4ºC, hasta el momento en que fueron utilizados. Se procedió a determinar si las muestras utilizadas realmente habían amplificado en un gel de agarosa al 3% teñido con bromuro de etídio en una cámara de electroforesis horizontal GNA200 de Pharmacia Biotech. Una vez se comprobó qué muestras habían amplificado, se corrieron éstas en geles denaturantes de poliacrilamida al 6% en una cámara vertical Hoefer SQ3 sequencer, con una fuente de poder EPS 3500 de Pharmacia biotech, a 35 W constantes durante 2-3 horas dependiendo del tamaño del marcador. Posteriormente se paso a la fijación (acido acético), tinción (nitrato de plata, AgNO3) y revelado del gel con carbonato de sodio (Na2CO3). El marcador de peso molecular utilizado fue 
174 cortado con Hind III situado cada 10 carriles.
Métodos genético poblacionales aplicados: Una vez los geles fueron analizados, y se distinguieron perfectamente los genotipos de los especimenes estudiados, se procedió a determinar algunos estadísticos genéticopoblacionales básicos, tales como el número de alelos por marcador, las frecuencias alélicas y la heterocigosis esperada insesgada con el método de Nei (1978). Una pérdida significativa de esta heterocigosis puede indicar claramente la acción de diferentes procesos estocásticos, como la deriva genética, o de procesos selectivos actuando en contra de un alelo particular y, por lo tanto, modificando las frecuencias alélicas (Ruiz-Garcia 1991).
Se procedió al análisis del equilibrio Hardy-Weinberg para algunos de los marcadores moleculares empleados para ciertos con-juntos de muestras. Para ello se utilizaron dos procedimientos diferentes. El primero fue la aplicación del estadístico F de Wright (1965), cuya expresión es:
F =1 -(Ho/He), dónde Ho es el número observado de heterocigotos y He es el número de heterocigotos esperados en equilibrio Hardy-Weinberg. La significación estadística del estadístico F puede medirse con la expresión:
X2 =F2 N (m -1), con m(m -1)/2 grados de libertad, dónde N es el número de individuos analizados y m es el número de alelos encontrados en cada locus (Li & Horvitz 1953). El segundo procedimiento analítico empleado fue la aplicación de la f de Robertson & Hill (1984). Para cada alelo i, la estima insesgada de la desviación de la frecuencia de homocigotos (ii), respecto a los valores esperados en equilibrio Hardy-Weinberg de estas frecuencias, tiene la siguiente expresión:
Tii=[2(2n - 1) nii - ni(ni - 1)]/[4 (n - 1)], dónde n es el tamaño de la muestra, nii es el número de homocigotos observados y ni es el número de alelos i en la muestra estudiada. Para cada alelo, la estima de f es:
]]> fii =4nTii/[ni (2n - ni)]. El estadístico total, para el locus en cuestión, será,fT=2 (Tii/ni)/(m -1), donde m es el número de alelos detectados en un locus determinado. Ambos, fii y fT, tienen expresiones matemáticas que permiten calcular la esperanza de sus varianzas.
El índice de fijación (FST), mide los efectos de la subdivisión de una población, que se traduce en la reducción de la heterocigosis en una subpoblación debido a la deriva genética. Este estadístico se define como: FST =(HT – HS)/HT, dónde HT es la heterocigosis esperada en la población total y HS es la heterocigosis promedio en el seno de las subpoblaciones. Utilizando FST, se calculó el grado de heterogeneidad genética entre diferentes poblaciones de Odocoileus y Mazama, y entre diferentes especies de Mazama. Para ello, se utilizó el procedimiento de Weir & Cockerham (1984).
Se obtuvieron estimas de flujo génico entre poblaciones de Odocoileus y entre poblaciones de Mazama clasificadas por especies, por regiones biogeográficas respecto a la procedencia de las muestras y por países. Para ello se utilizó el método de los alelos privados (Slatkin 1985) con el programa Genepop versión 3.1 (Raymond & Rousset 1995).
Empleando el programa Bottleneck versión 1.1.03 (Piry et al. 1999) se calculó la posible existencia de cuellos de botella recientes en las poblaciones de las diferentes especies de ciervos analizadas a partir de la teoría de Cornuet & Luikart (1996) y Luikart et al. (1998). Esta técnica se basa en el principio por el cual las poblaciones, que han atravesado un cuello de botella reciente, pierden simultáneamente número de alelos y niveles de heterocigosis esperada. Sin embargo, el número de alelos (ko) se reduce más rápidamente que los niveles de heterocigosis. De este modo, el valor de la heterocigosis esperada a partir del número de alelos presente (Heq), obtenido por métodos de coalescencia, es menor que la heterocigosis esperada obtenida directamente de las frecuencias alélicas (He). Este exceso de heterocigosis esperada respecto a la calculada mediante el número de alelos ha sido fehacientemente demostrado en el modelo mutacional de los alelos infinitos, aunque no está tan claradamente determinado para el modelo mutacional "step-wise" (Ohta & Kimura 1973). Los microsatélites empleados aquí, aunque su dinámica, posiblemente, puede estar más cercana al segundo modelo mutacional, no lo siguen estrictamente y tan pronto como un marcador se aparta ligeramente del modelo "step-wise" hacia el modelo de los alelos infinitos, el exceso de heterocigosis esperada comenzará a incrementarse como consecuencia de un cuello de botella reciente. Para marcadores neutrales, en una población en equilibrio deriva genética-mutación, existe la misma probabilidad que, para un locus dado, haya un ligero exceso o déficit de heterocigosis respecto a este mismo concepto calculado a partir del número de alelos. Por el contrario, una población que ha sufrido un cuello de botella presentará una amplia fracción de loci con un exceso significativo de heterocigosis esperada. Para medir esta probabilidad, se utilizaron cuatro procedimientos: el test del signo, el test de la diferencia estandarizada, el test del signo rango de Wilcoxon, y un descriptor gráfico de la forma de la distribución de las frecuencias alélicas. Una población, que no haya pasado por un cuello de botella, mostrará una distribución en forma L, tal como se espera en una población estable en equilibrio derivamutación. Por el contrario, una población que ha sufrido un cuello de botella reciente mostrará una distribución sesgada. El test de signorango de Wilcoxon es probablemente el más poderoso cuando el número de loci analizados es limitado como ocurre en el presente caso.
Resultados
Análisis de diversidad genética con loci microsatélites: En la Fig. 1 se pueden observar las frecuencias alélicas de las especies de ciervos neotropicales para los marcadores microsatélites empleados. Puede observarse (Cuadro 2) que la mayor cantidad de alelos fue obtenida para los marcadores Cervid 1, Cervid 3 e IDvGA 55, y que las especies neotropicales con mayor heterocigosis fueron Odocoileus virginianus (heterocigosis insesgada promedio H=0.6148), Mazama americana (H=0.6429) y Mazama gouazoubira (H=0.7003). Los ejemplares del género Cervus no amplificaron para ninguno de los marcadores específicos para Odocoileus y los del género Capreolus no lo hicieron para Cervid 1 ni para RM012. Respecto a los marcadores diseñados para renos, fueron probados únicamente en algunos especimenes y deben considerarse los resultados obtenidos como preliminares. Los ejemplares de Mazama rufina (H=0.125), Pudu mephistopheles (H=0.4062), Ozotoceros bezoarticus (H=0.50), Hippocamelus antisensis (H=0.5030) y Blastocerus dichotomus (H=0.3599) presentaron niveles de heterocigosis menores a las especies referidas anteriormente, aunque el número de muestras analizadas fue muy pequeña para algunas de esas especies. Es importante comparar esos niveles de variabilidad genética en los cérvidos neotropicales con los niveles determinados en especies de cérvidos europeos. Para los marcadores diseñados para bóvidos, encontramos que las muestras de los C. elaphus escoceses presentaron elevados niveles de variabilidad genética. Para esos microsatélites, la heterocigosis individual de cada animal analizado osciló entre el 0.7 y 1. La heterocigosis individual promedio incluyendo todos los C. elaphus escoceses fue de 0.8066, mientras que la heterocigosis insesgada promedio para el con-junto global de esas muestras fue de 0.8051. En el otro extremo de la escala, las muestras de C. nippon, introducidos en Gran Bretaña, fueron monomórficas para los 10 microsatélites aplicados en esta especie. Esto es, no se obtuvo diversidad genética alguna (H=0). El nivel estimado de diversidad genética en las muestras de C. elaphus procedentes de Italia fue considerablemente menor que el nivel encontrado para la población británica. Los animales, individualmente, poseyeron niveles de heterocigosis entre 0.166 y 0.6. El valor de la heterocigosis individual promedio fue de 0.383, mientras que la heterocigosis insesgada global para toda la muestra fue de 0.556. Los tamaños alélicos encontrados en los C. elaphus italianos coinciden con los tamaños alélicos encontrados en los británicos, aún cuando pueden pertenecer a subespecies diferentes. Capreolus capreolus presentó alelos similares en tamaño (95, 100 pares de bases, pb) a los reportados para Cervus en el marcador INRA131. Contrariamente, los alelos encontrados para esta especie, en TGLA337, son mucho más pequeños (112, 114 pb) que los reportados para Cervus (128 pb en adelante). Los C. capreolus de origen italiano, para este ultimo marcador, estuvieron fijados para un alelo de 112 pb, mientras que los de origen español lo estuvieron para un alelo de 114 pb. Capreolus mostró un alelo de 143 pb, para HUJ175, de tamaño mayor que los reportados para Cervus elaphus (115-133 pb). La heterocigosis individual promedio fue de 0.333 para C. capreolus. El marcador que presentó mayor variabilidad en las muestras de Dama dama procedentes de España fue TGLA337, con tres alelos de 124, 134 y 138 pb (H=0.333). El tamaño de esos alelos está dentro del rango de los encontrados en C. elaphus. En cambio, los del bóvido Rupicapra pyrenaica resultaron ostensiblemente menores (104, 108, 112, 118 pb) para ese marcador. D. dama italiano mostró un alelo de 123 pb para el marcador FCB193, lo cual coincide con el tamaño de los alelos reportados, anteriormente, para C. elaphus (97121 pb) y para C. nippon (123-139 pb).
Los cérvidos neotropicales analizados presentaron una variabilidad genética intermedia respecto a los dos extremos representados por C. elaphus y C.nippon. Mientras que Mazama americana, M. gouzaoubira y Odocoileus virginianus presentaron valores de heterocigosis bastante elevados, cercanos al conspicuo valor de los C. elaphus escoceses (H=0.71 en el estudio de Goodman et al. 2001; H=0.8066 en el presente estudio), las otras especies de ciervos neotropicales estudiados presentan niveles de variabilidad genética menores, pero nunca con un valor tan extremo en su pobreza como el estimado, y aquí mostrado, en C. nippon.
En el Cuadro 3 se presentan ]]>
Mazama), lo que pone en evidencia, la existencia de efecto Wahlund (=subdivision) por la existencia de acervos genéticos diferenciados en el seno de los géneros Mazama y Odocoileus en Latinoamérica. Este hecho viene dado por la gran cantidad de dudas ]]>
Mazama intragenéricamente y, por ello, se trabajó este género como una población total con diferentes subpoblaciones: una única población global (tomando todas las muestras de Mazama como una única población), por países, sin importar las especies, y por especies (o subespecies) teniendo en consideración las regiones biogeográficas de procedencia de las muestras. Como hasta el momento actual se desconoce cuantos y cuáles pueden ser los acervos genéticos diferentes en el seno de Odocoileus virginianus en Latinoamérica y en el seno de cada especie de Mazama e, incluso, cuantas especies diferentes de Mazama pueden ]]>
Mazama mostró un déficit significativo de heterocigotos para los marcadores Cervid 1 (p=0.0041), Cervid 3 (p=0.0000), IDVGA 55 (p=0.0105) y NVHRT 71 (p=0.0104) y para el conjunto global de todos los marcadores analizados en este género tomado como un todo (p=0.0000). Esto significa que no existe un único acervo genético para el género Mazama en toda la extensión geográfica analizada en Latinoamérica. Los individuos de Mazama ]]>
agrupados por países también mostraron un fuerte exceso de homocigotos para el marcador Cervid 1 (p=0.0022) y Cervid 3 (p=0.0073) en el caso de Colombia (lo cual denota la existencia de diferentes acervos genéticos para esos marcadores en la población de Mazama en ese país sudamericano), o para Cervid 3 (p=0.0422) en el caso de las Mazama de Bolivia. También, el taxón Mazama americana proveniente de la región amazónica peruana de Loreto mostró no estar en equilibrio Hardy-Weinberg para Cervid 3 (p=0.0157), ni para el conjunto global de todos los marcadores analizados (p=0.0000). Cuando se analizó el grupo total de Mazama americana, independientemente de los países de ]]>
Mazama gouzaoubira se encontró un déficit de heterocigotos para Cervid 1 (p=0.0421), Cervid 3 (p=0.0014) y para el conjunto global de todos los marcadores analizados (p=0.0052). Este descubrimiento revela la existencia de diferentes acervos genéticos en el seno de Mazama americana y de Mazama gouzaoubira, respectivamente. Por el contrario, no se encontraron desviaciones respecto al equilibrio Hardy-Weinberg para los conjuntos de muestras de ]]>
Mazama gouzaoubira de venezuela, Guyana Francesa, y Bolivia, ni para las agrupaciones de muestras de M. americana del departamento de Córdoba (Alto Sinú, Colombia), Bolivia y M. rufina, lo que puede significar que las muestras obtenidas en esas regiones geográficas forman acervos genéticos únicos bien definidos. Tampoco se registró ningún caso de desviación respecto al equilibrio Hardy-Weinberg para los conjuntos muestrales de Blastoceros dichotomus, Ozotoceros bezoarticus, Pudu mephistopholes, o Hippocamelus antisensis. Contrariamente, en el caso del género Odocoileus se registraron algunos casos de desviación ]]>
Weinberg por exceso de homocigotos. Para el
conjunto global de todas las muestras estudia
das de
O. virginianus
se detectó este fenómeno
para los marcadores Cervid 1 (p=0.0225),
Cervid 3 (p=0.0022) y para el conjunto glo
bal de marcadores analizados (p=0.0007), al
igual que para el grupo total de ejemplares
procedentes de Colombia (p=0.0002; p=0.0465
y p=0.0001, respectivamente). Por lo tanto,
en
Odocoileus virginianus
a nivel global de
Latinoamérica y a nivel de Colombia, al igual que en el caso global de Mazama, encontramos evidencia de la existencia de acervos genéticos altamente diferenciados. En el Cuadro 4, se muestran los ]]>
de Robertson & Hill (1984) y F de Wright (1965) para las poblaciones de cérvidos euro peos. Contrariamente a lo encontrado para las poblaciones de ciervos latinoamericanos, todas las muestras de ciervos europeos mostraron estar en equilibrio Hardy-Weinberg, ]]>
Capreolus capreolus en Italia.
Cuando se estimó el flujo génico entre las diferentes agrupaciones de Mazama sp., M. americana y ]]> M. gouzaoubira, los valores obtenidos fueron muy bajos (Nm=0.38-0.85). Igualmente, la estima de flujo génico entre las poblaciones de Odocoileus virginianus por países fue extremadamente baja (Nm=0.36). La única estima ligeramente elevada fue la que se encontró entre las dos poblaciones colombianas de esta especie (Cordillera central vs. Cordillera oriental) (Nm=1.44). Todo ello implica que el manejo conservacionista de las poblaciones de Mazama y de Odocoileus tiene que tener muy presente la elevada heterogeneidad genética, y el débil flujo génico, que parece ocurrir entre poblaciones de esos dos géneros de cérvidos neotropicales.
Detección de cuellos de botella en cérvidos neotropicales: El análisis de la detección de posibles cuellos de botella recientes para las diferentes especies y poblaciones estudiadas de cérvidos neotropicales, a partir de la teoría de Luikart
et al. (1998), no detectó evidencias fehacientes de la existencia de cuellos de botella para los taxones analizados con los loci microsatélites empleados (Cuadro 10). Los únicos casos que se aproximaron a esa situación fueron el de Odocoileus virginianus, para el conjunto global de muestras, mediante el test de Wilcoxon y para el ]]>
O. virginianus a nivel de Colombia para el marcador IDGA 55 para ambos modelos mutacionales, alelos infinitos y "step-wise" (p=0.0060 y p=0.0160, respectivamente) y para Hippocamelus antisensis, en el caso de Cervid 1 (p=0.0458). No obstante, no se puede enfatizar la detección clara y conspicua de cuellos de botella recientes en las ]]>
Es posible que el tamaño de las muestras y el número de marcadores se deban ampliar para aumentar el poder estadístico de las técnicas usadas en la detección de cuellos de botella.
Discusión
Cabe resaltar que, con certeza, sólo se observó la no amplificación de Cervid 1 y RM012 para los individuos de las especies del género Capreolus y de Cervid 1 y Cervid 3 en C. elaphus y C. nippon. Esto demuestra que existe una considerable cantidad de loci microsatélites conservados en especies y taxones diferentes de Artiodactyla, al igual que ocurre en otros grupos de mamíferos (Gortari ]]> et al. 1997; Slate et al. 1998; Ruiz-García 2005; Ruiz-García & Alvarez 2003; Ruiz-García et al. 2006). La mayor cantidad de resultados se obtuvieron para Odocoileus virginianus y Mazama americana. Esto no sólo se debe a la mayor cantidad de muestras analizadas de esas ]]> Mazama gouazoubira presentaron el más alto grado de polimorfismo y diversidad genética con los microsatélites empleados, aun cuando el tamaño muestral obtenido y el número estudiado de poblaciones fue considerablemente menor que en las dos especies precedentes.
Tal como se preveía, las muestras de C. elaphus de Escocia, una población conformada por la ]]>
C. nippon escocesa, mostrando un fuerte efecto fundador durante su formación a mediados del siglo XIX, o principio del siglo XX. Las restantes especies de cérvidos europeos y neotropicales presentaron diversidades genéticas intermedias entre esos dos valores extremos. De este modo, no parece que las ]]>
C. nippon en Japón (Goodman et al. 2001). En consonancia con esta afirmación, no se detectó ningún cuello de botella genético evidente en ]]>
et al. (1998). La única excepción fue la de Mazama rufina con una variabilidad genética considerablemente reducida (H=0.125). Sin embargo, el tamaño muestral utilizado para esta especie fue extremadamente pequeño (n =2). En general, utilizando otros marcadores moleculares, en los pocos estudios realizados con ciervos ]]>
et al. (1998), estudiando 453 pares de bases (pb) para la región de control del ADN mitocondrial de 54 ejemplares de Ozotoceros bezoarticus procedentes de séis localidades diferentes, encontraron niveles de diversidad genética extremadamente elevados (45 haplotipos con ninguna localidad compartiendo haplotipos; diversidad haplotípica =0.99 y 
(diversidad nucleotídica) =0.011-0.025). Moscarella et al. (2003), analizando 730 pb de la región de control en 26 individuos representando las tres subespecies de Odocoileus virginianus en Venezuela (O. v. gymnotis, O. v. goudotti, O. v. margaritae), mostraron ]]>
O. virginianus (Ellsworth et al. 1994; Purdue et al. 2000). Sin embargo, los niveles de p fueron ]]>
O. v. gymnotis (0.029) es elevado, el de O. v. margaritae (0.016) es medio y el de O. goudotti (0.005) es bajo. El resultado obtenido para esta última subespecie es muy similar al encontrado para Muntiacus crinifrons
, cérvido del sudeste asiático. Wu & Fang (2005), analizando también la región de control mitocondrial, encontraron nueve haplotipos en 44 ejemplares de esta especie con pequeños números efectivos históricos con un valor de p= 0.00562 muy pequeño, pero con una diversidad haplotípica considerable (0.862). Márquez et al. (2006), estudiando 601 pb de la región de control mitocondrial y 486 pb del citocromo-b mitocondrial en 127 especimenes de
Blastocerus dichotomus de cuatro áreas de la cuenca del río de La Plata, determinaron 17 haplotipos para la región de control en Brasil, Argentina y Bolivia pero, esos haplotipos únicamente difirieron por 1-8 substituciones nucleotídicas, mientras que con citocromo-b encontraron solo tres sitios variables que determinaron cuatro haplotipos. Igualmente, la diversidad haplotípica estimada para la muestra global (0.64) y para todas las muestras ]]>
, especialmente, bajo para esas dos muestras (0.0017 y 0.0012, respectivamente). En idéntica circunstancia, no se descubrió variación cariotípica (Duarte & Giannoni 1995) en esta especie.
Por otra parte, la heterocigosis esperada (H) obtenida con los microsatélites resultó considerablemente mayor que los valores obtenidos con isoenzimas y proteínas plasmáticas, como era de esperarse. Algunos ejemplos con cérvidos son los siguientes: Cervus elaphus atlanticus, H=0, C. e. scoticus, H=0.03, con 35 loci isoenzimáticos (Gyllensten et al. 1983); Mazama americana, H=0.070, M. gouazoubir a, H=0.079, Odocoileus virginianus del suroeste de Estados Unidos y de Surinam, H=0.078 y 0.036, respectivamente (Smith et al. 1986); poblaciones norteamericanas de C. elaphus, H=0.012-0.034, utilizando 16 loci isoenzimáticos (Glenn & Smith 1993); poblaciones híbridas ]]> C. elaphus y C. nippon, para 15 marcadores, H=0.051 y 0.033 (Herzog et al. 1991); Dama dama, en Inglaterra y Gales para 30 loci, H=0 (Pemberton & Smith 1985); Odocoileus virginianus, para ocho poblaciones y 35 loci, H=0.049-0.092 (Smith et al. 1985); Alces alces, 18 poblaciones estudiadas en Escandinavia para 23 loci, H=0.006-0.047 (Ryman et al. 1980). Oliveira et al. (2005) analizaron 147 individuos de Blastocerus ]]> procedentes de tres áreas del río Paraná con 17 loci isoenzimáticos. Once de esos loci resultaron monomórficos, siendo los seis restantes polimórficos (polimorfismo del 35.29 %) con H=0.0631 y el número promedio de alelos por locus de 1.47±0.45. Recordemos algunos de los valores de H obtenidos en el presente trabajo con loci microsatélites: C. elaphus en Escocia, H=0.81; C. elaphus en ]]> Odocoileus virginianus en Colombia, H=0.62, Dama dama en España, H=0.73, Mazama gouzaoubira, H=0.70 o Blastocerus dichotomus, tan solo con 8 individuos, H=0.36.
Con los resultados obtenidos para la estima del equilibrio Hardy-Weinberg deben hacerse dos anotaciones. La primera de ellas es que las poblaciones que no se encontraron en ]]> Mazama y Odocoileus, especialmente) recogían individuos de diferentes localidades geográficas en diferentes puntos de Latinoamérica. De este modo, la ausencia de equilibrio Hardy-Weinberg por exceso de homocigotos puede estar promovida por efecto Wahlund (= subdivisión). Esto es, por efecto de subdivisión geográfica debido a la existencia de acervos genéticos bien diferenciados en el seno de esas especies y géneros en diversos países latinoamericanos. Un caso excepcional se dio para la muestra de Mazama americana procedentes de la región de Loreto, Amazonía peruana. Todos los individuos analizados pertenecieron a una misma región geográfica relativamente pequeña. La falta de equilibrio podría explicarse, en ese caso, por la existencia de consanguinidad en el seno de esa población o por la existencia en simpatría de dos especies de Mazama , similares morfológicamente, pero todavía no determinadas taxonómicamente. Esto ya ha sido reportado por otros autores para otros grupos de Mazama (Duarte & Merino 1997). Estos autores mostraron que dos especies de Mazama, aparentemente idénticas desde el punto de vista morfológico, poseían cariotipos diferentes.
]]> El análisis de heterogeneidad genética (FST ) mostró poblaciones del género Mazama fuertemente diferenciadas para los loci Cervid 1 y Cervid 3. La importancia de este hecho reside en la utilidad de estos marcadores para diferenciar ejemplares de diversas procedencias, lo que es de mucha utilidad cuando no se posee la certeza del origen geográfico de los ejemplares, como es el caso de individuos decomisados. Por otro lado, es apreciable que el flujo genético entre las poblaciones de Mazama es muy ]]> Odocoileus virginianus que se encuentran en la cordillera central y oriental de los Andes colombianos. Por lo tanto, resulta evidente una fuerte heterogeneidad genética entre las diversas especies de Mazama y en el interior de M. americana. Esto es equiparable a lo encontrado en otras especies de ciervos neotropicales con otros ]]> et al. (1998) estimaron una fuerte
ST =0.268-0.523 con promedio 0.37, p <0.002). Únicamente, dos poblaciones argentinas ]]>
ST =0.064, p=0.17). La estima de flujo génico entre estas dos poblaciones fue elevada (Nm=7.1). Sin embargo, la estima promedio de flujo génico entre todas las poblaciones a partir del estadístico
ST y a partir del método de Slatkin & Maddison (1989) (0.87 y 0.5) muestran el fuerte aislamiento genético entre esas poblaciones de este ciervo. El ]]>
Mazama americana del área amazónica de Loreto en Perú es similar a lo encontrado en Ozotoceros bezoarticus. En el interior de las poblaciones brasileñas de esta especie los ]]>
Blastocerus dichotomus de la cuenca del río de La Plata (Márquez et al. 2006) resultó altamente significativa tanto entre regiones (
CT =0.56, p=0.02) como entre poblaciones dentro de las regiones (
SC =0.25, p=0.00), aunque, también, lo fue dentro de las poblaciones (
ST =0.67, p=0.00). De nuevo, el aislamiento por distancia explicó una proporción importante de las diferencias genéticas entre las poblaciones estudiadas (r =0.792, p <0.05). No obstante, entre tres poblaciones de esta especie en la cuenca del río Paraná, la heterogeneidad fue mucho más moderada (FST =0.049; ]]>
et al. 2005). También es destacable la heterogeneidad genética significativa entre todas las poblaciones de O. virginianus estudiadas aquí en diversos países y entre las poblaciones de O. virginianus de Colombia y Venezuela. Este resultado es concordante con la heterogeneidad genética que presenta esta especie, por ejemplo, en Venezuela (Moscarella et ]]>
. 2003). Entre todas las poblaciones venezolanas estudiadas, la heterogeneidad resultó altamente significativa (
ST=0.27, p <0.0001), aunque, especialmente, entre O. v. goudotti (población andina) y O. v. margaritae (población insular caribeña) (
ST =0.60), reflejada entre tres grupos genéticamente bien diferenciados (Italia central, el grupo alpino relacionado con poblaciones de Francia, España y Noruega, y las poblaciones del este de Europa) se formaron en tres refugios diferentes del sur de Europa durante el Pleistoceno superior. ]]>
Mediante la teoría de Cornuet & Luikart (1996) y Luikart et ]]>
. (1998) se estimó la posible existencia de cuellos de botella recientes en las poblaciones neotropicales de ciervos analizadas, obteniéndose resultados no significativos en todos los casos. Debe aclararse que para algunas de estas especies, como Ozotoceros bezoarticus, Pudu mephistopheles y Mazama rufina, el pequeño número de ejemplares ]]>
Ozotoceros bezoarticus aunque, actualmente, no superan los 60.000-80.000 individuos, esas poblaciones constaron de millones de individuos debido a la elevada diversidad genética que posee esa especie actualmente (González et ]]>
. 1998). Eso significa que la reducción demográfica es un evento muy reciente que todavía no ha tenido repercusión en los niveles de variabilidad genética de esa especie. Algo similar ha sido reportado para otras especies de cérvidos. Por ejemplo, Balakrishnan et al. (2003) determinaron, en tres subespecies de Cervus eldi del sudeste asiático (
C. eldi eldi, C. e. thamin, C. e. siamensis) en estado crítico, sus correspondientes diversidades genéticas a partir de 478 pb de la región de control mitocondrial. Dos de ellas todavía muestran una muy elevada diversidad (C. e. thamin: h=0.82, p=0.024 y C. e. siamensis: h=0.81, p=0.014), lo que refleja que, en el pasado, esas poblaciones contaban millones de individuos ]]>
Blastocerus dichotomus del Pantanal brasileño parece que experimentó una expansión poblacional hace entre 25 000 y 28 000 años. La utilización de loci microsatélites para poder determinar la estructura genética de cérvidos neotropicales, al igual que la secuenciación de genes mitocondriales, y un muestreo más intensivo de esas especies es decisivo para tener un conocimiento preciso y exacto de la historia natural de las mismas y, ]]>
Agradecimientos
Los autores agradecemos enfáticamente a todas aquellas personas que ayudaron en la tarea de obtener muestras biológicas de cérvidos neotropicales. Entre ellas cabe destacar a Hugo Gálvez de Iquitos (Perú) y a Andrés Eloy Bracho de Maracaibo (Venezuela). También se agradece la obtención de muestras por parte de Armando Castellanos (Ecuador), Francois Catzeflis (Francia) y Jordi Jordana (España). Las comunidades indígenas Yaguas, Ticunas y Huitoto de la Amazonía Colombiana y a las comunidades indígenas Bora, ]]>
Resumen
Los programas ]]> Mazama americana, M. gouzaoubira, M. rufina, Odocoileus virginianus, Hippocamelus antisensis, Pudu mephistopholes, Ozotoceros bezoarticus y Blastoceros dichotomus) y, adicionalmente, en varias especies de cérvidos europeos y asiáticos (Cervus ]]> and Dama dama). Una de esas especies europeas, la población de Cervus elaphus en Escocia, fue tomada como una población con un grado muy elevado de diversidad genética ya que proviene del cruce de diferentes grupos de ]]> Cervus nippon) en Escocia, que prácticamente no mostró variabilidad a nivel molecular. Respecto a esos dos casos que consideramos como de elevada y escasa variabilidad genética, encontramos que las poblaciones analizadas de Mazama americana, M. gouzaoubira y Odocoileus virginianus estuvieron cerca del límite máximo encontrado para el ciervo rojo escocés (H=0.64, 0.70 y 0.61, respectivamente), mientras que M. rufina mostró el más bajo grado de variabilidad genética de las especies neotropicales, cercano al extremo mínimo presentado por C. nippon. ]]> Mazama y de Odocoileus, tomadas a nivel macrogeográfico, mostraron un exceso de homocigotos debido, probablemente, a la existencia de efecto Wahlund (efecto de subdivisión). Ninguna de las especies analizadas parece haber atravesado un cuello de botella reciente.
Palabras claves: Cérvidos Neotropicales, Mazama, Odocoileus, microsatelites de ADN, genética de poblaciones.
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