Claribel Hernández¹, Manuel Ruiz-García²*, Leonard Munstermann³& Cristina Ferro⁴

1. Secretaria de Salud de Cundinamarca, Bogotá DC, Colombia.

2. *Correspondence: Grupo de Genética de Poblaciones Molecular y Biología Evolutiva (Unidad de Genética). Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Cra 7A No 43-82. Bogotá DC. Colombia. mruiz@javeriana.edu.co

3. Yale University, New Haven, Connetticutt, EEUU.

4. Instituto Nacional de Salud. Bogotá DC. Colombia.

Abstract: Genetic structure in five Phlebotominae (Lutzomyia spp.), townsendi series, verrucarum group, in Colombia (Diptera: Prychodidae). Sixteen isoenzyme patterns were analyzed for five Colombian Lutzomyia species. The average unbiased expected heterozygosity levels ranged from 0.098 (Lu. youngi) to 0.215 (Lu. torvida). The five species samples, taken all the isoenzymes employed, were significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium by homozygous excess with classical as well as Markov chain exact tests. Possible causes: (1) Wahlund effect within populations due to subdivision and/or sampling. Endogamy could be discarded because these loci were affected by highly different levels of homozygous excess. (2) Null alleles could be not discarded, at least for some isoenzymes. The hierarchical Wright´s F analysis showed high and significant values for each parameter. The average F_IT value was 0.655 with a conspicous homozygous excess at a global level (all species taken together); the average F_IS value was significantly positive (0.515) as well, with homozygous excess within each species. The genetic heterogeneity between the fives species was noteworthy (F_ST = 0.288), indicating clear genetic differentiation. The more related species pairs were Lu. longiflocosa-Lu. torvida (0.959) and Lu torvida-Lu. spinicrassa (0.960); while Lu. torvida-Lu. youngi (0.805) and Lu. quasitownsendi-Lu. youngi (0.796) were the most divergent (Nei´s genetic identity matrix). UPGMA and Wagner algorithms showed that the most divergent species was Lu. youngi, whereas the most related were Lu. longiflocosa-Lu. torvida and Lu torvida-Lu. spinicrassa. A spatial autocorrelation analysis (Moran´s I index) revealed a very weak, or inexistent spatial structure, which means that the speciation events between these species were independent from the geographic distances from where they currently live. Rev. Biol. Trop. 56 (4): 1717-1739. Epub 2008 December 12.

Key Words: Isoenzymes, population genetics, Lutzomyia, verrucarum group, Colombia.

Las leishmaniosis son zoonosis causadas por parásitos protozoos intracelulares obligados del género Leishmania. La forma infectan te, promastigote, es inoculada al ser humano a través de la picadura de un insecto vector del género Lutzomyia (Subfamilia Phlebotominae), durante la ingesta sanguínea. Estas enferme dades actualmente prevalecen en cuatro con tinentes. Son consideradas endémicas en 88 países. Aproximadamente, 350 millones de personas viven en estas áreas. Sólo 32 países tienen notificación obligatoria. En realidad, un número substancial de casos nunca se reporta. De los 1.5-2 millones de nuevos casos que se estiman que ocurren anualmente, solo 600 000 se reportan oficialmente. La distribución geográfica de las leishmaniasis está limitada por la distribución de los flebótomos (Clase Insecta, Orden Diptera, Suborden Nematocera, Familia Prychodidae, Subfamilia Phlebotominae). Su susceptibilidad a climas fríos, sus preferencias alimenticias y su capacidad para soportar el desarrollo interno de especies especificas del parásito los hace excelentes propagadores de la enfermedad (WHO 2000, 2002). Las leishmaniosis presentan una variedad de manifestaciones clínicas que difieren ampliamente en severidad y en su impacto sobre la salud humana. La infección puede cursar de manera asintomática, producir discretas lesiones en la piel o por el contrario, destruir la mucosa orofaríngea, infiltrar el bazo y la médula ósea produciendo una enfermedad sistémica que lleva a la muerte.

De las 500 especies de flebótomos conocidas, solo 30 de ellas han sido identificadas como vectores de la enfermedad (WHO 2000, 2002). El género Lutzomyia contiene la mayoría de los Phlebotominae americanos con cerca de 400 especies divididas en numerosos subgéneros, grupos y series. Se considera el grupo verrucarum como uno de los grupos de flebotomineos neotropicales más importantes en salud pública, con 42 especies divididas en cuatro series: serrana (10 spp), verrucarum (15 spp), pia (8 spp) y townsendi (9 spp). Diez de estas especies están señaladas como importantes vectores potenciales y confirmados de Leishmania spp y Bartonella bacilliformis. La serie townsendi conformada por nueve taxones, presenta siete especies en Colombia (Bejarano et al. 2003), asociadas con la leishmaniosis cutánea y mucocutánea en focos endémicos donde Leishmania (Viannia) braziliensis (Lainson 1983) es el principal agente etiológico. Las especies presentes en Colombia son Lu. townsendi, Lu. sauroida, Lu. longiflocosa, Lu. torvida, Lu. spinicrassa, Lu. quasitownsendi y Lu. youngi. Las cinco últimas son objeto de estudio del presente trabajo presentando una distribución altamente endémica, especialmente abundante en áreas montañosas y bien adaptadas a los cultivos de café, tanto tradicionales como tecnificado. Lu. longiflosa, Lu. torvida y Lu. quasitownsendi poseen una distribución exclusivamente colombiana, mientras que Lu. spinicrassa se localiza también en venezuela y Lu. youngi en Colombia, venezuela y Costa Rica. Las hembras de esta serie son picadoras agresivas, altamente antropofílicas (Young 1979), marcadamente similares en estructura morfológica (isomórficas) y es difícil identificarlas sin asociarlas con los machos (Young 1979, Feliciangeli y Murillo 1987, Kreutzer et al. 1990), caracterizados por una espina basal aislada y tres espinas dístales en el estilo de la terminalia (Feliciangeli y Murillo 1987, Kreutzer et al. 1990).

Para separar esas especies de flebótomos se han utilizado varias metodologías: isoenzimas (Kreutzer et al. 1990), amplificación al azar de ADN polimórfico (RAPD; Adamson et al. 1991,1993), hidrocarburos cuticulares e hibridación de ADN (Maigon et al. 1993), estructura coriónica (Feliciangeli et al. 1993, Sierra et al. 2000), morfometría (Pérez 1996, Añez et al. 1997), morfología del atrio genital (valenta et al. 1999), citogenética (Escobar 2000) y secuencias de genes mitocondriales y nucleares (Rojas et al. 2000).

El presente trabajo muestra los resultados del análisis electroforético de 16 loci isoenzimáticos con especial referencia en la determinación de los niveles de variabilidad genética, estructura y divergencia genética entre esas especies y a la determinación de la estructura espacial mediante autocorrelación en los procesos de especiación entre Lu. longiflocosa, Lu. torvida, Lu. spinicrassa, Lu. quasitownsendi y Lu. youngi, provenientes de focos endémicos colombianos de leishmaniasis cutánea.

Trabajo de Campo: Las capturas de flebótomos se realizaron en cinco localidades colombianas (Cuadro 1), por aspiración directa utilizando Trampas Shannon y cebo humano protegido. Con el fin de obtener una F1, las hembras recolectadas se colocaron en una jaula de muselina y se alimentaron con hámster anestesiado para asegurar la producción de huevos (Killick-Kendrick et al. 1997). Luego, se colocaron en vasos con yeso (hembras alimentadas y no alimentadas) para la ovoposición. Finalmente, se transportaron dentro de neveras de icopor al Insectario del Laboratorio de Entomología del INS (Bogotá – Cundinamarca). ]]>

Obtención de la F1 y Congelación: En el laboratorio las hembras se separaron individualmente en vasos de cría (Endris et al. 1982) con el fin de obtener machos y hembras descendientes de la misma madre. Los especimenes, machos y hembras de cada camada, se agruparon por sexo a medida que emergían y se preservaban congelados a – 80 ^o C en un congelador hasta su procesamiento para los isoenzimas. La madre y un descendiente macho de la primera generación, se aclararon en una solución de Hidróxido de Potasio al 10 %, se montaron en una mezcla de fenol-bálsamo de Canadá para su posterior identificación taxonómica siguiendo la clave de Young y Duncan (1994) y para conservarlos en la colección de referencia del INS, como material de referencia.

Método Electroforético: La electroforésis se realizó en geles verticales de poliacrilamida al 6 %. Se utilizaron dos soluciones tampón: TC (tris-citrato) y TBE (tris-borato-EDTA), para maximizar la separación electroforética de las isoenzimas y para visualizar las bandas en los geles se empleó un procedimiento de coloración histoquímico específico para cada uno de los 16 enzimas estudiados (Cuadro 2). Los tamaños muestrales fueron superiores a 30 individuos en todas las especies analizadas. Solo los ejemplares adultos (recién emergidos) fueron procesados para la electroforesis.

Análisis genético poblacional: Los alelos se identificaron alfabéticamente de acuerdo al valor estimado de frente de corrido (Rf). Los valores de Rf de las electroformas en el gel para cada locus se calcularon usando las referencias comerciales de las enzimas y está dado por la relación entre el valor de la distancia recorrida por una banda desde el origen del gel y el valor de la distancia recorrida por la banda de la enzima comercial respectiva. Los alelos codificados para la misma enzima se designaron numéricamente desde el más cercano al cátodo hasta el más cercano al ánodo. Se determinaron las frecuencias génicas de los respectivos marcadores, la heterocigosis esperada promedio, los estadísticos F de Wright, estimas indirectas de flujo génico y diversas distancias genéticas (Nei 1978, Cavalli-Sforza y Edwards 1967). Con las matrices de distancias genéticas se obtuvieron diversos dendrogramas aplicando los métodos UPGMA y Wagner (programa Biosys-2). Para ratificar las relaciones genéticas entre las especies estudiadas de Lutzomyia se aplicó un análisis de escalas multidimensionales con una función monótona (Kruskal 1964 a,b) a partir de las matrices de correlaciones y distancia Euclídea. Se utilizaron 50 iteraciones para calcular los estadísticos denominados stress 1 y stress 2, los cuáles miden la bondad de ajuste de las distancias en el espacio configuracional con la función monótona de las distancias originales.

Una matriz gráfica ("minimum spanning tree") se superimpuso para observar la distorsión local probable generada por este proceso de reducción dimensional (Gower y Ross 1969).

I = n ∑_ij w_ij z_i z_j /W ∑_{i=1...n zi}²

donde n es el número de localidades objeto de estudio, ∑_ij indica la suma sobre todas las especies i de la primera a la n y j de la primera a la n, con i diferente a j; w_ij es la ponderación dada a la relación entre las localidades i y j (w_ij puede ser diferente de w_ji); z_i = Y_i – Y, donde Y_i es el valor de la variable Y para la especie i, e Y es la media de Y para todas las especies estudiadas; y W = ∑_ij w_ij es la suma de matriz de pesos, con i diferente a j. Para muestras grandes, el valor de I oscila aproximadamente entre + 1 a –1 y su valor aproximado esperado en ausencia de autocorrelación es 0. Una figura con los coeficientes de autocorrelación frente a las distancias geográficas conforma un correlograma espacial. Los puntos geográficos fueron conectados mediante una red de Gabriel (Gabriel y Sokal 1969, Matula y Sokal 1980). Se realizaron dos análisis de autocorrelación espacial, uno con 3 clases de distancias (CD) cuyos límites superiores fueron 103, 176 y 302 km de distancia y otro con 4 CD, cuyos límites geográficos superiores fueron 76, 139, 176 y 302 km de distancia. En ambos análisis, el número de pares de comparaciones fue aproximadamente el mismo. La forma de los correlogramas permite determinar qué eventos evolutivos pudieron producir la aparición de las especies estudiadas. Estos análisis fueron aplicados a los 13 loci polimórficos y siempre se descarto el alelo con frecuencia genica mas baja en cada locus estudiado. Se determinó la significación estadística de los coeficientes de autocorrelación con el procedimiento de Bonferroni (Oden 1984). En tercer lugar se procedió a un análisis de correlación de las superficies de las variables mediante el coeficiente de correlación de Pearson ( r ). Se contabilizó el porcentaje de correlaciones superior a |0.7|. valores superiores a esta cifra muestran marcadores que poseen superficies similares. La última prueba realizada fue un análisis de similitud de los correlogramas. Para llevar a cabo esto, se calcularon las matrices de distancia de Manhattan entre todos los pares posibles de los 13 loci polimórficos. Este análisis es útil para investigar si cada una de las variables genéticas analizadas ha estado bajo la acción de los mismos procesos evolutivos espaciales. Sokal y Wartenberg (1983) y Sokal et al. (1989) mostraron con simulaciones computacionales que pares de correlogramas generados por los mismos procesos evolutivos tienen distancias de Manhattan promedio inferiores a 0.1 para el índice I de Moran. Para mostrar gráficamente las relaciones espaciales de las variables estudiadas se procedió a aplicar el algoritmo UPGMA y un procedimiento de clasificación no jerárquico, k-means (Spath 1983)

Estructura Genética: Mediante la f de Robertson y Hill (1984), se determinaron las desviaciones de las proporciones genotípicas observadas respecto a las esperadas en equilibrio Hardy-Weinberg (EHW). Los porcentajes de desviación de este equilibrio para Lu. longiflocosa, Lu. torvida y Lu. spinicrassa fueron de 69.23 % (9 de los 13 loci polimórficos presentaron valores significativos a nivel P < 0.05), para Lu. quasitownsendi 76.92 % (10/13) y para Lu. youngi de 23.33 % (3/13). Desviaciones significativas por exceso de homocigotos fueron detectadas para cuatro loci (Aco, Pgm, Fum y Est-2) en Lu. longiflocosa, seis loci (Aco, Aat-2, Pgm, Mdh-2, Fum, y Est-2) en Lu. torvida, seis loci (Ak, Aat-2, Pgm, Gpi, Me y Est-2) en Lu. spinicrassa, cinco loci (Aco, Aat-2, Pgm, Fum y Est-2) en Lu. quasitownsendi y dos loci (Aat2, y Est-2) en Lu. youngi. Los marcadores que no estuvieron en EHW fueron diferentes entre las especies. Por ejemplo: Ak, Gpi y Me mostraron un exceso de homocigotos para Lu. spinicrassa pero no para las demás especies. Mdh-2 presentó un exceso de homocigotos para Lu. torvida, no encontrado en las otras cuatro especies.

La estructura genética para cada uno de los 13 loci polimórficos se analizó con los estadísticos F de Wright (1965) y se resume en el cuadro 5. El promedio de F_IS (desviación respecto al EHW dentro de cada especie) para los 13 marcadores fue elevado y significativo (F_IS = 0.5152, P < 0.00001). Los marcadores genéticos que contribuyeron más decisivamente a esta desviación significativa fueron Me, Est-2, Fum, Pgm, Aco, Aat-2 y Ak, todos ellos por exceso de homocigotos. Otros marcadores mostraron valores F_IS negativos, aunque no significativos debido a exceso de heterocigotos (6-pgdh, Idh, Mdh-1 y Hk). El valor promedio de F_IT (desviación respecto al EHW para el conjunto global de todas las especies de Lutzomyia analizadas) fue significativamente elevado (F_IT = 0.655; P < 0.00001). Ocho marcadores presentaron una diferenciación significativa para F_IT, por un conspicuo exceso de homocigotos, Me, Est-2, 6-pgdh, Pgm, Fum, Aat-2, Aco, y Ak. Mdh-1 y Hk mostraron valores de F_IT negativos aunque no significativos. Globalmente, el grado de heterogeneidad inter – especies es medido mediante el estadístico F_ST ( = 0.2884, P < 0.00002). Este valor es elevado y muestra una pronunciada diferenciación genética entre las especies, ratificando que son unidades reproductivas aisladas. Los marcadores que mostraron heterogeneidad más elevada fueron 6-pgdh, Gpi, Pgm, Est-2 y Aat so de homocigotos, Me, Est-2, 6-pgdh, Pgm, 2. Por lo tanto, esos son los marcadores que más discriminan entre los taxones estudiados.

Basándose en el promedio de F_ST, se calculó una estima teórica de flujo génico, Nm (número medio de inmigrantes que entran en una población por generación) = 0.6168, lo cual revela que, efectivamente, las poblaciones analizadas no intercambian individuos entre sí. Incluso, si se aplica un modelo isla n-dimensional, la estima de flujo génico es prácticamente nula (Nm = 0.2435)

Diferenciación Genética: Los valores de la identidad (I) y de la distancia genética (D) de Nei (1978) entre las especies estudiadas se muestran en el cuadro 6. La divergencia genética de Lu. youngi respecto a las otras especies colombianas fue considerable, con valores de D oscilando entre 0.169-0.228. Las otras cuatro especies presentaron valores menores, oscilando entre 0.041 y 0.075). Las especies más relacionadas fueron Lu. longiflocosa-Lu. torvida y Lu torvida-Lu. spinicrassa mientras que las genéticamente más distantes fueron Lu. torvida-Lu. youngi y Lu. quasitownsendi-Lu. youngi (0.796). La relación genética entre las 5 especies se presenta gráficamente en el dendrograma con el método de Wagner (Fig .1). El análisis de escalas multidimensionales (MSD), tanto con la matriz de correlaciones como con la matriz de distancias euclídea, mostró que las especies Lu. longiflocosa, Lu. spnicrassa y Lu. torvida están altamente relacionadas entre sí, mientras que las especies Lu. quasitownsendi y, especialmente, Lu. youngi son mucho más distantes. Lu. quasitownsendi estaría relacionada con Lu. torvida y Lu. youngi con Lu. longiflocosa (Fig. 2). El ajuste de los datos en MSD fue extremadamente bueno ya que los estadísticos stress 1 y 2 fueron igual a 0, en todos los casos.

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Autocorrelación Espacial: Se realizaron diferentes análisis de autocorrelación espacial. En primera instancia, se tomaron tres clases de distancia (CD) cuyos límites geográficos superiores fueron 103, 176 y 302 Km. También se realizó un análisis con 4 CD cuyos límites geográficos superiores fueron 76, 139, 176 y 302 Km. Para el caso de tres CD, el 11.49 % de los índices I de Moran fue significativo (10 de 87 casos). Globalmente, únicamente el alelo Gpi-B mostró un correlograma globalmente significativo (p = 0.029) con la tercera CD (176-302 km) significativamente negativa. Es decir, en este caso las especies más distantes geográficamente fueron también las que difieren más fuertemente para este marcador. 6-pgdh-B, Pgm-B y Est2-C también presentaron la primera CD positiva (relación fuerte entre especies próximas geográficamente) y la última CD significativamente negativa (diferencias considerables entre especies distantes geográficamente). Sin embargo, para ninguno de estos 3 alelos, el correlograma global fue significativo. Aat2-C, Idh-A y Est2-E exhiben correlogramas con aspecto de "depresión" o clina circular, ya que de 103 a 176 km existe una fuerte caída en la similitud genética. Sin embargo, globalmente, estos correlogramas no fueron significativos. Esto es, solo se puede afirmar que existe una tendencia a la presencia de una clina circular o, en un hábitat casi lineal, la existencia de dos clinas convergentes cerca del centro de la zona estudiada pero sin alcanzar una significación estadística. Gpi-E, Hk-A y Hk-B mostraron un valor negativo para la primera CD (diferencias genéticas remarcables entre especies cercanas geográficamente). Sin embargo, para el primer alelo se obtuvo en la 2 CD (103-176 km) un valor significativamente positivo, indicando que las especies a esta distancia son más similares genéticamente entre sí de lo esperado simplemente por azar. Para los alelos HK-A y HK-B, las especies más distantes geográficamente fueron también las significativamente más similares. No obstante, ninguno de esos correlogramas fue significativo globalmente. En el análisis de 4 CD, solo el 9.82 % de los coeficientes fue significativo (11/112), valor que no es significativamente diferente del error tipo I del 5 %. Al igual que en el caso anterior, Gpi-B fue el único alelo que presentó un correlograma globalmente significativo (p = 0.023). Otros alelos que presentaron algunos coeficientes significativos, pero sin que los correlogramas globales alcanzaran ese estado, fueron: 1/ 6-pgdh-B, con la 1 CD positiva y significativa (fuerte parecido entre las especies situadas a menos de 76 km de distancia) y la última CD fuertemente negativa (176302 km), indicando fuerte disimilitud entre las especies situadas a esa distancia. 2/ Para Pgm-A y Pgm-B, también se dio una fuerte disimilitud genética entre las especies situadas más distantemente. 3/ Aat2-B mostró una fuerte disimilitud genética entre las especies más cercanas geográficamente. 4/ Idh-B, Est2-C y Est2-E presentaron aspecto de clina circular ya que la 3 CD (139-176 km) fue significativamente negativa. Finalmente, Fum-c mostró la 1 CD significativamente positiva, indicando un fuerte parecido entre las especies separadas en los primeros 76 km de distancia. Las restantes variables no mostraron ningún tipo de sistema especial en ninguno de los análisis. Esto indica que, en general, la distancia geográfica entre las especies estudiadas no es un factor demasiado trascendente en los fenómenos de especiación entre ellas. El correlograma promedio para las 28 variables estudiadas no fue significativo, ratificando la idea anterior (Cuadro 7).

El porcentaje de correlaciones con un valor superior a |0.7| fue del 18.41 %, lo cual fue superior significativamente al error del 5 % (151/820; c² = 71.377, 1 grado de libertad, P < 0.000001). Eso significa que una proporción significativa de las superficies de un conjunto de variables estudiadas están correlacionadas significativamente.

Por el contrario, el porcentaje de distancias de Manhattan entre pares de correlogramas inferiores a 0.1 para el análisis de autocorrelación espacial con 3 CD fue extremadamente bajo (3.44 %, 13/378). Este valor no se diferenció del error tipo del 5 % y, por lo tanto, se concluye que, desde el punto de vista espacial, no existen fuerzas evolutivas globales que hayan afectado de forma similar a las variables analizadas. El análisis UPGMA (Fig. 3) muestra algunas asociaciones espacialmente importantes como serían los casos de Gpi-c, Gpi-F y Me-A; Pgm-A y Pgm-B; y, finalmente, Hk-A y Hk-B. Sin embargo, globalmente ese número de asociaciones es muy bajo. Exactamente las mismas conclusiones se alcanzan con el análisis de autocorrelación espacial con 4 CD. El porcentaje de pares de correlogramas con distancias de Manhattan inferiores a 0.1 fue tan solo de 3.17 % (12/378), lo cual ni siquiera alcanza el error tipo del 5 %. El correspondiente análisis UPGMA mostró que solo las variables Mdh1-A, Mdh2-c, Gpi-F y Me-A; los alelos Mdh2-B y Gpi-E; Hk-A y Hk-B; y Pgm-A y Pgm-B, presentaron pequeños valores de las distancias de Manhattan, lo cual es compatible con el hecho que los mismos eventos evolutivos espaciales hayan esculpido de igual forma sus correspondientes correlogramas. Los restantes marcadores poseen correlogramas con formas propias no similares entre sí. Se puede concluir globalmente que la dinámica espacial de las variables analizadas está afectada por muy diferentes eventos evolutivos.

Discusión

Diversidad genética: El polimorfismo isoenzimático en las cinco especies estudiadas de Lutzomyia, (grupo verrucarum, serie townsendi) fue elevado. Trece de los 16 marcadores analizados fueron polimórficos (81,3 %). El porcentaje de polimorfismo encontrado es lo suficientemente elevado como para utilizar esos marcadores con fines genético poblacionales e, incluso, filogenéticos. Kreutzer et al. (1990) encontraron un porcentaje similar de marcadores polimórficos en este grupo, aunque ligeramente más elevado (95.2 %).

Cuatro de las cinco especies presentaron alelos diagnósticos, es decir, restringidos a una sola especie. De este modo, Aat-2-D, Gpi-A y Hk-C son útiles para diferenciar a Lu. longiflocosa, Gpi-F y Me-B a Lu. spinicrassa, Mdh-1-B, Mdh2-C y Fum-A a Lu. quasitownsendi y Est-2-A e Idh-C a Lu. youngi. Esto muestra la utilidad de los marcadores isoenzimáticos en su poder de discriminación de especies en el seno del género Lutzomyia.

El nivel medio de heterocigosis esperada para las cinco especies no fue excesivamente elevado (0.098-0.215). Esto puede ser atribuido a la presencia reciente de efectos fundadores recientes en las localidades muestreadas, o a un bajo flujo genético entre poblaciones en el seno de cada especie, con incidencia de la deriva genética en cada una de ellas. Sin embargo, los marcadores isoenzimáticos tradicionalmente muestran valores de diversidad genética ostensiblemente más bajos que otro tipo de marcadores moleculares, como microsatélites, VNTRs o AFLPs. Es frecuente que áreas recientemente colonizadas posean poblaciones con menor diversidad genética respecto a poblaciones originales o ancestrales. Generalmente, las áreas de dispersión original de una especie son las que presentan niveles más elevados de variabilidad genética (Dobzhansky 1971). El valor de H para Lu. youngi fue 0.098, el valor menor, mientras que para Lu. torvida fue 0.215 (el valor mayor), lo cual indicaría que, de las cinco especies analizadas, Lu. youngi poseería la menor distribución geográfica y sería la población más moderna formada a partir de un cuello de botella reciente, mientras que Lu. torvida sería la especie con mayor distribución geográfica original y la más antigua, si se tiene en consideración los niveles de diversidad genética. Sin embargo, la distribución geográfica actual para estas dos especies es contraria a lo esperado por los resultados genéticos, ya que Lu. youngi presenta una distribución en Centroamérica (Costa Rica, dos localidades) y Suramérica (venezuela, 6 localidades – Colombia, 8 localidades), mientras que Lu. torvida posee una distribución geográfica restringida a Colombia, en una sola localidad. Kreutzer et al. (1990) encontraron un ámbito de H = 0.082-0.171, para 10 especies de Lutzomyia del grupo verrucarum. Estos valores están dentro de un ámbito muy similar al reportado en el presente estudio.

Estructura genética: Se detectaron fuertes desviaciones respecto al EHW, predominando un exceso de homocigotos para el global de los loci analizados para las cinco especies estudiadas. Lu. quasitownsendi presentó el mayor número de marcadores genéticos en desequilibrio HW (76.92 %), siendo así, la especie que más se apartó del citado equilibrio. Las desviaciones afectaron principalmente a cinco loci, Aco, Aat-2, Pgm, Fum y Est-2. Este hecho puede estar favorecido por diversas causas: (1) Es probable que se esté dando efecto Wahlund en el seno de cada una de las citadas especies debido a subdivisión geográfica real y/o a subdivisión temporal generacional en el seno de cada poblaciones. Se encontraron algunos marcadores, como Idh y Hk, que generalmente estuvieron en EHW en todas las especies estudiadas, mientras que otros mostraron un claro exceso de homocigotos en todas las especies (Pgm, Fum y Est-2). Esto no es compatible con un exceso de homocigotos por endogamia, porque ésta debe actuar de manera idéntica en todo el genoma y el exceso de homocigotos debería, por lo tanto, ser general para todos los marcadores analizados. El hecho que algunos marcadores presenten exceso de homocigotos y otros estén en equilibrio o presenten exceso de heterocigotos, parece favorecer la explicación de un exceso de homocigotos por efecto Wahlund (= subdivisión) más que por endogamia como posible explicación evolutiva de los resultados encontrados. (2) La sistematicidad con la que ciertos marcadores presentan exceso de homocigotos en todas las especies analizadas, también, puede ser un síntoma relacionado con la actuación de fuerzas selectivas positivas para las combinaciones homocigóticas en esos marcadores. (3) Sin embargo, no se puede descartar la existencia de alelos nulos, al menos, en algunos de los marcadores isoenzimáticos utilizados que mostraron exceso de homocigotos. (4) Otra posibilidad es que el tipo de muestreo y selección de los individuos analizados no se haya realizado realmente al azar. Sin embargo, eso no explicaría porqué sistemáticamente ciertos marcadores no están en equilibrio y otros sí en todas las especies.

El análisis jerarquizado con las F de Wright mostró valores elevados y significativos para cada uno de los estadísticos empleados. El valor promedio de F_IT fue positivo y significativo (F_IT = 0.655) con un conspicuo exceso de homocigotos a nivel global en todas las especies. Este resultado revela, efectivamente, que las cinco poblaciones estudiadas de Lutzomyia representan especies reales, porque el intercambio genético entre ellas es extremadamente bajo. El estadístico promedio F_IS fue también significativamente positivo (0.515), con exceso de homocigotos en el interior de cada especie. Esto ratifica que en el seno de cada una de ellas también existe una fuerte división genética. La heterogeneidad entre las cinco especies fue altamente significativa (F_ST = 0.288), mostrando que, en promedio, cada especie únicamente posee el 71.2 % de la diversidad genética total encontrada en Lutzomyia. El locus 6-pgdh mostró el valor de F_ST más elevado, seguido por Gpi, Pgm y Est-2. Estos son, pues, los marcadores que más fuertemente discriminan entre las especies analizadas. Los loci que muestran niveles inusualmente elevados de subdivisión poblacional respecto a otros loci, se señalan frecuentemente como indicadores de selección positiva diversificante por adaptación local. Este puede ser el caso para esos marcadores. Contrariamente, el locus Mdh-1 presentó el valor más pequeño de F_ST. Para este locus no se pueden descartar fenómenos selectivos constrictivos que lo estén afectando.

Las estimas de flujo génico (Nm = 0.62 y Nm = 0.24), indican una virtual ausencia de intercambio genético entre las poblaciones analizadas, lo cual refuerza el concepto que realmente cada una de ellas representa un linaje evolutivamente independiente. Wright (1931, 1943) mostró que si Nm > 1, el flujo génico es suficientemente elevado para anular las diferencias genéticas entre las poblaciones involucradas que estén en equilibrio respecto a la deriva genética y al flujo génico en un modelo neutral isla infinito. En un modelo "stepping-stone", Nm debe ser superior a 4 para prevenir la diferenciación genética. Si 1 < Nm < 0.5, en ese mismo modelo genético poblacional, la diferenciación genética entre dos poblaciones será leve, pero extremadamente importante en un modelo genético poblacional "stepping-stone". Si Nm < 0.5, las poblaciones consideradas están fuertemente desconectadas para cualquier modelo poblacional. Por lo tanto, los resultados aquí obtenidos muestran claramente que las poblaciones estudiadas están ampliamente desconectadas desde la perspectiva genética.

Relaciones genéticas entre las poblaciones estudiadas: La presencia de 27 especies del grupo verrucarum en Colombia y venezuela, permite sugerir al noroccidente de Suramérica como el lugar de origen del citado grupo. La especiación del grupo parece ser el resultado de diversos eventos biogeográficos y climáticos que han afectado la flora y fauna de la región andina. Una interpretación para tal diversificación, especialmente para la serie townsendi, es el aislamiento de poblaciones ancestrales en refugios de bosque húmedo durante el periodo cuaternario. Cambios climatológicos importantes se dieron durante el Cuaternario (Pleistoceno y Holoceno, 1.6 millones de años hasta el presente). Especialmente importante para la aparición de refugios fueron los ciclos de Milankovitch (cada 19 000-24 000 años, cada 43 000 años y cada 90 000-100 000 años durante todo el Cenozoico, incluyendo el Pleistoceno) operando durante el Cuaternario, con fases cálidas y secas alternando con épocas más frías y húmedas (Haffer 1997, Whitmore y Prance 1987).

El origen de la serie townsendi podría estar en un componente de la serie verruca-rum ampliamente diseminado, el cual quedó aislado en pequeñas poblaciones en las zonas elevadas de los Andes. Las especies de esta serie en Colombia presentan una distribución con registros puntuales entre las Cordilleras Occidental y Oriental, lo que demuestra una adaptación evolutiva muy específica a las grandes alturas (Bejarano et al. 2003). No es fácil determinar a partir de cuales poblaciones se formaron las del grupo verrucarum. Es posible que ciertas poblaciones hayan experimentado un efecto fundador, con actuación de la deriva genética más intensamente que otras. Los resultados presentes muestran que las especies más relacionadas son Lu. longiflocosa-Lu. torvida (0.959) y Lu. torvida-Lu. spinicrassa (0.960) mientras que las genéticamente más distantes fueron Lu. torvida-Lu. youngi (0.805) y Lu. quasitownsendi-Lu. youngi (0.796). Los valores de identidad genética obtenidos fueron similares a los encontrados por Kreutzer et al. (1990) (I = 0.988 – 0.665) para cinco especies de la serie townsendi, presentes en venezuela y Colombia. Ayala (1975) efectuó estimaciones de la diferenciación genética en los procesos de especiación alopátrica en el grupo de Drosophila willistoni. Las poblaciones locales de una misma especie presentaron un valor promedio de I de 0.970 + 0.006, lo cual es muy similar a las relaciones encontradas entre Lu. longiflocosa-Lu. torvida y Lu. torvida-Lu. spinicrassa. Entre subespecies y especies incipientes, los valores fueron muy similares (0.795 + 0.013 y 0.798 + 0.026, respectivamente) concordando con los valores más elevados encontrados en el presente estudio (Lu. torvida-Lu. youngi y Lu. quasitownsendi-L. youngi). En ningún caso, las estimas de las identidades genéticas obtenidas fueron tan pequeñas como las encontradas entre especies sinmórficas (I = 0.563 + 0.023) y especies alomórficas (I = 0.352 + 0.023) en el grupo de D. willistoni. No obstante, existen numerosos ejemplos documentados donde la existencia de aislamiento reproductivo ha tenido lugar con mínimos cambios en genes estructurales. Algunos ejemplos son suficientes. D. pseudoobscura del altiplano cundiboyacense colombiano posee un grado de aislamiento reproductivo importante respecto a sus conespecíficos norteamericanos debido tan solo a 4 loci (Prakash 1972). Igualmente, Chrysopa carnea y C. downesi (neurópteros) se diferenciaron reproductivamente tan solo por cambios en 3 loci (Tauber y Tauber 1977). Muchas de las más de 500 especies de Drosophila en las islas Hawai, muestran elevadas identidades genéticas entre sí (I = 0.94-0.99, Carson et al. 1975, Sene y Carson 1976), lo mismo que formas aisladas reproductivamente de D. athabasca (I = 0.91, Johnson 1978). Lo mismo habita en otros insectos, como es el caso del lepidóptero Speyeria (5 especies, I = 0.89-0.98, Brittnacher et al. 1978), o, incluso, entre vertebrados, como es el caso de peces del género Cyprinidon (5 especies, I = 0.81-0.97, Turner 1974) o especies de Roedores donde la especiación se da por mecanismos cromosómicos estasipátricos (Spalax ehrenbergi, I = 0.978, Proechimys guairae, I = 0.969, Ayala 1975, Benado et al. 1979). Este podría haber sido el caso entre algunos de los taxones de Lutzomyia estudiados.

El árbol UPGMA con la distancia de Nei mostró que la especie más divergente es Lu. youngi, mientras que las relaciones más conspicuas se observan entre Lu. longiflocosa-Lu. torvida y Lu. torvida-Lu. spinicrassa. La divergencia de Lu. youngi respecto a las otras especies puede estar dada por un aumento en la deriva genética en el momento de su formación o por la existencia de eventos selectivos sobre uno o varios de los loci polimórficos estudiados que desviaron su perfil genético del resto de las especies analizadas. Sin embargo, la hipótesis de la diferenciación por deriva genética parece más factible ya que Lu. youngi presentó los niveles promedios de H más bajos y fue la especie que reveló, en general, menor número de alelos en los loci polimórficos estudiados. La interpretación de este resultado parece favorecer, por lo tanto, la hipótesis de que la aparición del Istmo de panamá pudo haber afectado la distribución de Lu. youngi permitiendo el paso de esta especie entre Sur y Centroamérica (Bejarano et al. 2003).

La existencia de heterogenidad genética significativa (medida por el estadístico F_ST), la existencia de una escasa autocorrelación espacial, de un porcentaje significativo de asociación entre las superficies de un cierto grupo de las variables estudiadas, y de la inexistencia de similitud entre los patrones de los correlogramas de los alelos estudiados, nos permiten rechazar ciertos eventos evolutivos como los más probables en la diferenciación genética de las especies estudiadas. La existencia de una moderada estructura espacial, de débil correlación entre las superficies y de débil paralelismo entre los correlogramas permitió proponer al efecto fundador (mecanismo estocástico) como el agente evolutivo más importante en la estructura genética de los humanos de la isla de Bougainville (Sokal y Friedlaender 1982). Los indígenas Yanomami presentaron una fuerte estructura espacial y débil correlación entre las superficies alélicas y débil paralelismo de correlogramas. Deriva genética y fenómenos de fisión-fusión fueron propuestos como los agentes evolutivos básicos que habían operado espacialmente en estos indígenas (Sokal et al. 1986). Para la colonización, por parte de los humanos, de Europa y el Próximo Oriente con el estudio de frecuencias de HLA, se determinó un fuerte porcentaje de casos significativos tanto para la estructura espacial, como para la correlación de las superficies y para el paralelismo de los correlogramas. La migración por difusión resultó el evento más probable en la determinación de esas características genéticas (Sokal y Menozzi 1982). Lo mismo ocurrió para una población de caracoles, Helix aspersa (Sokal y Oden 1978a). Drosophila buzzatii, en el este de Australia, mostró una estructura espacial moderada, una débil correlación de superficies y un moderado paralelismo de los correlogramas (con algunas agrupaciones significativas). Selección natural en niveles jerárquicos diferentes fue la explicación invocada para este ejemplo (Sokal et al. 1987). Como en nuestro caso, no se da ninguna de esas combinaciones, todas esas posibles explicaciones evolutivas pueden ser descartadas como los agentes básicos en la diferenciación genética de las especies de Lutzomyia estudiadas aquí. Obviamente, como no se dio homogeneidad estadística para el conjunto de isoenzimas estudiados, explicaciones como idéntica adaptación a los mismos ambientes o poblaciones grandes con elevado flujo génico y panmixia pueden ser inmediatamente descartados. El hecho, que exista una muy limitada cantidad de autocorrelación espacial significativa, muestra que la distancia geográfica entre las especies analizadas no ha jugado un papel demasiado destacado en la diferenciación genética de los loci estudiados. Sin embargo, el hecho que exista heterogeneidad significativa con pérdida de patrones espaciales significativos puede ser explicado, al menos, con dos posibles explicaciones (Sokal y Jacquez 1991). Poblaciones aisladas, sin flujo génico entre ellas, posibilitaría la actuación de la deriva genética en cada localidad, la cual podría ser independiente en magnitud y dirección entre las poblaciones cercanas. Otra posibilidad es la existencia de parches ambientales (con diferente presión de selección natural) dispuestos espacialmente al azar. Sin embargo, podemos distinguir entre esos dos modelos puros examinando la correlación entre las superficies y el paralelismo entre los correlogramas. En el primer modelo, las superficies génicas no deberían estar correlacionadas, ya que la deriva genética habrá actuado de forma diferente en cada locus. En el segundo modelo, se deben encontrar pequeñas y significativas agrupaciones de variables correlacionadas siguiendo una misma presión de selección en los diferentes parches debido a un factor ambiental dado. Este segundo caso, se ajusta perfectamente a los resultados. Como esos factores selectivos solo afectaran de forma idéntica a una pequeña parte de las variables analizadas, la similitud entre los correlogramas será muy baja. Sin embargo, los procesos estocásticos, como la deriva genética, aunque generan diferentes funciones que resultan en patrones independientes de las frecuencias génicas, generan similares correlogramas porque los patrones tienen la misma estructura de varianza-autocovarianza tal como demostraron Sokal y Wartenberg (1983). Es decir, si los fenómenos de aislamiento por distancia y deriva genética fueran fuertes, esperaríamos un porcentaje elevado de similares formas en los correlogramas, fenómeno no observado en los presentes datos. Por lo tanto, podemos concluir que, en conjunto, para las variables analizadas, los fenómenos de diferenciación genética (y, quizás, de especiación) entre las especies consideradas han sido más afectados por la selección natural dependiente de parches ambientales dispuestos al azar con actuación en ciertos alelos que por la acción de los procesos estocásticos, como la deriva genética, que permiten la diferenciación por distancia.

Futuros estudios moleculares deberán revelar una relación más precisa entre los cambios climáticos y geológicos del Cuaternario y la filogeografía y fuerte especiación de Lutzomyia en los Andes sudamericanos.

Agradecimientos

Al Instituto Nacional de Salud y a Colciencias por la ayuda financiera que permitió la realización de este estudio. A Olga Lucía Cabrera (Laboratorio de Entomología, Instituto Nacional de Salud) por su colaboración en la colonización de las especies de Lutzomyia en el laboratorio. A la Pontificia Universidad Javeriana por brindar la capacidad computacional para llevar a cabo los análisis genético poblacionales. A Diana Alvarez por su ayuda en la realización de las figuras y tablas.

Resumen

Se analizaron 16 sistemas isoenzimáticos para cinco especies colombianas del género Lutzomyia. Los niveles de heterocigosis media esperada insesgada oscilaron entre 0.098 (Lu. youngi) y 0.215 (Lu. torvida). Las cinco muestras estudiadas de forma global, para todos los marcadores analizados, presentaron desviación respecto al equilibrio Hardy-Weinberg por un exceso de homocigotos, tanto al utilizar algunas pruebas clásicas como tests exactos con cadenas de Markov. Este hecho puede estar favorecido por diversas causas: (1) la más probable es la existencia de efecto Wahlund en el seno de cada población debido a subdivisión y/o a la técnica de muestreo empleada. La endogamia puede descartarse ya que no todos los loci están afectados por el mismo tipo de exceso de homocigotos. (2) Sin embargo, no se puede descartar la existencia de alelos nulos, al menos, para algunos de los marcadores isoenzimáticos utilizados. El análisis jerarquizado con las F de Wright mostró valores elevados y significativos para cada uno de los estadísticos. El estadístico promedio ^FIT mostró un valor de 0.655 existiendo un conspicuo exceso de homocigotos a nivel total de todas las especies, el estadístico promedio F_IS fue altamente positivo (0.515) mostrando exceso de homocigotos a nivel individual en cada una de las especies estudiadas. La heterogeneidad genética entre las cinco especies fue notable (F_ST = 0.288). Esto muestra que esas especies están bien diferenciadas a nivel isoenzimático y que en el interior de cada especie también hay una subdivisión genética. La matriz de identidades genéticas de Nei muestra que las especies más relacionadas fueron Lu. longiflocosa-Lu. torvida (0.959) y Lu torvida-Lu. spinicrassa (0.960) mientras que las genéticamente más distantes fueron Lu. torvida-Lu. youngi (0.805) y Lu. quasitownsendi-Lu. youngi (0.796). Con los algoritmos UPGMA y Wagner, se observó que la especie más divergente fue Lu. youngi, mientras que las relaciones más conspicuas se observaron entre Lu. longiflocosa-Lu. torvida y Lu torvida-Lu. spinicrassa. Adicionalmente, con un análisis de autocorrelación espacial (índice de Moran) la mayoría de los alelos utilizados presentaron una estructura espacial muy débil o inexistente, lo que significa que los eventos de especiación entre las especies estudiadas se dieron en forma independiente de las distancias geográficas existentes actualmente entre ellas.

Palabras Clave: Isoenzimas, genética de poblaciones, Lutzomyia, grupo verrucarum, Colombia.

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