Teiji Kifune1, Rafael Lamothe-Argumedo2, Luis García-Prieto2, Alejandro Oceguera-Figueroa2 & Virginia León-Règagnon2
1 Departamento de Parasitología, Escuela de Medicina, Universidad de Fukuoka, Fukuoka 814-0180, Japón.
2 Laboratorio de Helmintología, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, A.P. 70-153, C.P. 04510, México, D.F., México. email: vleon@ibiologia.unam.mx; gprieto@ibiologia.unam.mx
Recibido 02-V-2002. Corregido 06-II-2004. Aceptado 12-II-2004.
Abstract
Human gnathostomiasis is a food-born parasitic disease of relative importance in many countries in Southeast Asia. It is caused by several species of nematodes of the genus Gnathostoma. In Mexico is an emerging public health problem since 1970, when first cases were reported. Until today, larval morphometric characters that have been proposed to differentiate between the three species of Gnathostoma present in this country, are not satisfactory. Recently, the presence of advanced third-stage larvae AdvL 3 (infective form for humans) in freshwater fishes from Pantanos de Centla, Tabasco, was recorded but their specific identity was not clarified. Examination of four species of freshwater fishes from the same locality revealed that three of them: Petenia splendida (n=58), Cichlasoma managuense (n=35) and Gobiomorus dormitor (n=9) were infected by 15 AdvL 3 of Gnathostoma binucleatum. Specific identity was obtained comparing the internal transcribed spacer 2 (ITS2) of the ribosomal DNA with sequences reported in Genbank. This is the first record of G. binucleatum in P. splendida and G. dormitor from Tabasco and the first specific determination of the parasite in the locality.
Key Words: Gnathostoma binucleatum, Gnathostomiasis, Tabasco, Mexico, freshwater fishes, ITS2, DNA.
]]> La Gnatostomiasis es una enfermedad producida en el hombre y vertebrados silvestres por nemátodos del género Gnathostoma Owen, 1836, en cuyo ciclo de vida intervienen un copépodo como primer hospedero intermediario, un pez como segundo y un mamífero como definitivo; el hombre se infecta accidentalmente al ingerir carne cruda de peces de agua dulce. Su distribución abarca diversos países de Asia y América, en algunos de los cuales constituye un problema de salud pública importante (Lamothe- Argumedo 1997).
Los primeros casos humanos de esta enfermedad fuera de Asia, fueron registrados en México por Peláez y Pérez-Reyes (1970); desde entonces, su número se ha incrementado de manera gradual en el país, estimándose en 8000 en la actualidad (Lamothe-Argumedo et al. 2001).
La presencia de larvas de tercer estadio avanzado (L3A) del nematodo se ha señalado en vertebrados de 12 estados de la República Mexicana, infectando al hombre en diez de ellos (Lamothe-Argumedo 1997, Lamothe- Argumedo et al. 2001); particularmente en el estado de Tabasco, López- Jiménez y García-Magaña (2000) registraron tres especies de peces como
hospederos del parásito; sin embargo, no establecieron su identidad específica, ya que en la actualidad, las L3A de las tres especies del género que se distribuyen en México (Gnathostoma binucleatum Almeyda-Artigas, 1991, Gnathostoma turgidum Stossich, 1902 y Gnathostoma procyonis Chandler, 1942), no pueden diferenciarse claramente con bases morfológicas. Por esta razón, el principal objetivo de nuestro estudio es realizar la identificación específica del parásito, a través de la obtención de la secuencia del espaciador interno 2 (ITS2) del ADN ribosomal y de su comparación con las secuencias de otras especies publicadas en estudios previos (Almeyda-Artigas et al. 2000, León-Règagnon et al. 2002).
Materiales y métodos
Durante marzo de 2001, se recolectaron cuatro especies de peces: 58 ejemplares de Petenia splendida, Günther 1862, 35 de Cichlasoma managuense Günther 1867 (=Heros managuensis), cinco de Cichlasoma urophthalmus Günther 1862 y nueve de Gobiomorus dormitor Lacèpéde 1798, en la Laguna San Pedrito (92º33’9" W; 18º23’2" N), localizada en el Municipio de Centla, Tabasco, México. La musculatura de cada pez fue molida individualmente, comprimiéndola entre dos placas de vidrio para observarla a contraluz bajo un microscopio estereoscópico en búsqueda de larvas. Las larvas recolectadas fueron fijadas en alcohol al 70% caliente para su estudio morfométrico (n=6 larvas), aclarándolas con lactofenol de Amann y en etanol absoluto para su análisis molecular (n=2 larvas). La infección se caracterizó de acuerdo con los parámetros propuestos por Margolis et al. (1982); ejemplares de referencia fueron depositados en la Colección Nacional de Helmintos (CNHE), Instituto de Biología, UNAM, México, con los números de catálogo: 4426 y 4427.
La obtención del ADN se efectuó individualmente mediante el método estándar de extracción fenol / cloroformo (Hillis et al. 1996). Para amplificar el ITS2 se utilizó la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) con los iniciadores NEWS2 (delantero) 5’TGTGTC-GATGAAGAACGCAG e ITS2- RIXO (reversa) 5’TTCTATGCTTAAATTCAGGGG (Almeyda-Artigas et al. 2000). El programa de amplificación fue el siguiente: 1 min a 94ºC; 35 ciclos de 30 s a 92ºC, 30 s a 45ºC y 1 min a 72ºC; elongación final de 4 min a 72ºC. Los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de purificación QIAquick (QIAGEN), secuenciándose directamente con un secuenciador automático ABI Prism 310. Las secuencias obtenidas se alinearon con las de G. binucleatum (Genbank Z97072), G. turgidum (Genbank Z97175) y Gnathostoma spp. (Genbank Z97172 y Z97173).
Resultados
De las cuatro especies de peces examinadas, tres se encontraron parasitadas por L3A de Gnathostoma: C. managuense (prevalencia= 8.6%, abundancia promedio= 0.08 larvas por hospedero revisado), P. s p lendida (15.5%, 0.15) y G. dormitor (22.2%, 0.3). Las dos primeras especies pertenecen a la familia Cichlidae y la última a la familia Eleotridae, recuperándose un total de 15 larvas. De éstas, únicamente seis presentaron condiciones óptimas para su estudio morfométrico; asimismo, considerando que todas eran indistinguibles, se utilizaron dos para su estudio molecular, número que asegura la obtención de ADN en cantidad suficiente.
]]> Las L3A analizadas, son menores a 0.5 cm de longitud; se caracterizan por presentar un bulbo cefálico armado con cuatro hileras de ganchos y un par de labios flanqueando la boca; cada labio está provisto de un par de papilas. El cuerpo está totalmente cubierto por hileras transversales de espinas simples. En el Cuadro 1 se resumen los caracteres morfométricos comúnmente empleados para la diferenciación de las especies del género en etapa larvaria.Finalmente, en este estudio se obtuvo la secuencia completa del ITS2 de dos L3A recolectadas de la musculatura de C. managuense y G. dormitor. El segmento secuenciado tiene un total de 421 pares de bases y es idéntico en los dos ejemplares (Figura 1; número de acceso Genbank: AF503204). A su vez, esas dos secuencias difieren únicamente en dos sitios con respecto a la de G. binucleatum disponible en Genbank (Z97072), por lo que se signaron a esta especie.
Discusión
Petenia splendida y G. dormitor representan nuevos hospederos para el parásito en la zona, ya que anteriormente se le había registrado (como Gnathostoma sp.) en Belonesox belizanus Kner, 1860, C. managuense y Rhamdia guatemalensis Günther, 1864 en la misma localidad (López- Jiménez y García-Magaña 2000). Ambas especies de peces han sido señaladas previamente como hospederos inter-mediarios de G. binucleatum en seis localidades de México (Pérez-Ponce de León et al. 1996, Lamothe- Argumedo 1997, Almeyda-Artigas et al. 2000); sin embargo, en ninguna se ha establecido el nivel de la infección, lo que impide realizar comparaciones con nuestros resultados. De la misma forma, la prevalencia y abundancia promedio registradas para G. dormitor en Tabasco, sugieren su actuación como hospedero preferencial del parásito en la zona; no obstante, el tamaño reducido y desigual de las distintas muestras analizadas, no permite concluir al respecto.
]]> El hallazgo de estas larvas en peces dulceacuícolas de Tabasco y su identificación como G. binucleatum, ponen de manifiesto el peligro potencial de la transmisión de la infección al hombre, ya que esta especie es la única registrada hasta ahora como parásito del mismo en México (León- Règagnon et al. 2002). Lo anterior es ratificado por Wong-Ortíz et al. (2001), quienes reportaron el primer caso humano de gnatostomiasis en el estado de Tabasco.Hasta la fecha, el número de especies de peces registradas como segundos hospederos intermediarios de Gnathostoma spp., en México asciende a 25, pertenecientes a ocho familias; entre ellas, las mejor representadas son Cichlidae con 11 especies, Eleotridae con cinco y Ariidae con tres. La frecuencia con la que se registra a miembros de estas tres familias como hospederos de las L3A en distintas zonas de México como Guerrero (León-Règagnon et al. 2000), Nayarit (León-Règagnon et al. 2002), Oaxaca- Veracruz (Lamothe-Argumedo 1997), Tamaulipas (Almeyda-Artigas et al. 2000) y ahora Tabasco (López-Jiménez y García Magaña 2000 y el presente estudio), podría ser indicativa de la composición característica del espectro hospedatorio del nematodo en los cuerpos de agua del país.
La identificación específica de las larvas del género Gnathostoma en Asia, se basa principalmente en el número de ganchos de las cuatro hileras del bulbo cefálico, asi como en el valor promedio de los núcleos presentes en las células intestinales (Akahane et al. 1994). Más aún, especies como G. nipponicum Yamaguti, 1941, pueden identificarse por carecer de una cuarta hilera de ganchos cefálicos (Miyazaki 1991). Sin embargo, la utilización de la morfometría para la determinación de las especies registradas en México se dificulta por el conocimiento parcial de la las características de L3A de G. procyonis (Ash, 1962), la carencia total de información sobre el mismo estadio en el caso de G. turgidum y por el sobrelapamiento de rasgos que G. binucleatum exhibe con respecto a G. spinigerum y G. procyonis, particularmente si consideramos el intervalo de variación de los mismos (Cuadro 1). Lo anterior ha determinado que numerosos estudios efectuados sobre el parásito en México hayan realizado su determinación a nivel genérico exclusivamente (Lamothe-Argumedo et al. 1989, Funata et al. 1993, Akahane et al. 1994, Rojas-Molina et al. 1999, León-Règagnon et al. 2000, López-Jiménez y García-Magaña 2000). Esta problemática taxonómica, común a diversos grupos de organismos, ha propiciado el uso de otro tipo de herramientas para lograr su solución; entre ellas sobresalen los datos moleculares y en particular las secuencias de ADN, que ofrecen una gran cantidad de caracteres potencialmente útiles para resolver problemas taxonómicos.
Específicamente sobre el género Gnathostoma, se han realizado estudios moleculares con el fin de probar la validez de G. binucleatum, especie americana de morfología muy similar a G. spinigerum (Almeyda-Artigas et al. 2000) y de lograr la identificación específica de las L3A en otras regiones del país (León-Règagnon et al. 2002).
Al comparar las secuencias de G. binucleatum, G. turgidum y Gnathostma spp., disponibles en Genbank con la obtenida en este estudio, observamos que en cuanto a la primera, presentan solo dos diferencias, esto es, una divergencia de 0.475%, mientras que con las restantes no se logró un alineamiento confiable, registrándose una divergencia mayor al 50%.
La divergencia encontrada entre las secuencias de las larvas de Tabasco y la de G. binucleatum en Genbank es ligeramente mayor que la reportada en estudios previos (Almeyda-Artigas et al. 2000, León-Règagnon et al. 2002). No obstante, identificamos a los ejemplares aquí estudiados como G. binucleatum, ya que de acuerdo con Almeyda-Artigas et al. (2000), esta región del ADN ribosomal presenta una alta variación interespecífica, mayor al 7.29%, porcentaje claramente superior al obtenido en este estudio con relación a G. binucleatum (0.475%), que asumimos como variación propia de la especie.
Finalmente, consideramos necesario profundizar en el estudio de la variación del ITS2 en este grupo y explorar otras regiones del ADN para obtener información precisa acerca de los límites específicos y la variación de los caracteres morfológicos de las L3A de las especies americanas del género.
Agradecimientos
A Leticia García Magaña y Serapio López Jiménez, de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, por las facilidades brindadas para la realización de este trabajo. Este estudio fue parcialmente financiado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica PAPIIT-UNAM, proyecto IN204600 y por el Programa de Apoyo a la Investigación Científica Internacional del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón.
]]>La gnatostomiasis humana se adquiere al ingerir pescado de agua dulce crudo o insuficientemente cocido, infectado con larvas de tercer estadio avanzado (L3A) de nemátodos del género Gnathostoma. En el sureste de Asia, este padecimiento tiene una importancia relativa; en México, se le considera un problema de salud pública emergente desde 1970, cuando fueron registrados los primeros casos. Hasta la fecha, no se han establecido con precisión los caracteres morfométricos para diferenciar las L3A de las tres especies del género distribuidas en este país. Recientemente, se registraron larvas del parásito en peces dulceacuícolas de los Pantanos de Centla, Tabasco, sin definir su identidad específica. El análisis de cuatro especies de peces de la misma localidad reveló que tres de ellos: Petenia splendida (n=58), Cichlasoma managuense (n=35) y Gobiomorus dormitor (n=9), resultaron positivas a la infección por Gnathostoma binucleatum. La identificación del parásito se obtuvo comparando la secuencia del espaciador interno 2 (ITS2) del ADN ribosomal del material de Tabasco, con secuencias disponibles en Genbank. Este trabajo constituye el primer registro de G. binucleatum en P. splendida y G. dormitor de Tabasco y la primera determinación a nivel específico del parásito en la localidad.
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