Vanessa Nielsen ^1,2 , Priscilla Hurtado¹ , Daniel H. Janzen³ , Giselle Tamayo¹ & Ana Sittenfeld^1,4

1 Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio), Santo Domingo de Heredia, Costa Rica.

2 Dirección actual: Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, 2060 San José, Costa Rica.

3 Department of Biology, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA.

4 Dirección actual: Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica.

vnielsen@cariari.ucr.ac.cr, phurtado@inbio.ac.cr, gtamayo@inbio.ac.cr, djanzen@sas.upenn.edu, sitten@racsa.co.cr

Recibido 21-I-2003.      Corregido 19-I-2004.       Aceptado 04-II-2004.

This study describes the results and collection practices for obtaining arthropod samples to be studied as potential sources of new medicines in a bioprospecting effort. From 1994 to 1998, 1800 arthropod samples of 6-10 g were collected in 21 sites of the Área de Conservación Guancaste (A.C.G) in Northwestern Costa Rica. The samples corresponded to 642 species distributed in 21 orders and 95 families. Most of the collections were obtained in the rainy season and in the tropical rainforest and dry forest of the ACG. Samples were obtained from a diversity of arthropod orders: 49.72% of the samples collected corresponded to Lepidoptera, 15.75% to Coleoptera, 13.33% to Hymenoptera, 11.43% to Orthoptera, 6.75% to Hemiptera, 3.20% to Homoptera and 7.89% to other groups. Different life stages per arthropod species were obtained in most samples, 54.26% of them were adults, 19.90% corresponded to larvae, 6.46% to pupae, 6.12% to pre-pupae, 2.07% to nymphs and 3.74% to other stages. Other materials associated to insects like frass represented 11.20% of the samples collected. Several collecting methods were explored, based on the possibility of accessing the necessary amount of material causing the less impact. Most of the samples were obtained by manual collection (44.38%), followed by insects breeding (25.73%), light traps (18.80%), different types of nets (10.52%) and other methods (0.16%). In general, collecting methods and practices excluded the use of solvents, mixing different species or life stages in the same bag, which might have introduced undesirable effects in the screening systems for new compounds. Based on the possibility of finding new chemicals in similar samples associated to one arthropod species, the collecting strategy included the generation of several samples from same species, separated according to differences in life stages, collecting sites, ecosystems, seasons, feeding materials or behavioral aspects. This strategy allowed the generation a larger number of samples submitted to bioassays in different areas of pharmaceutical research.

Key words: bioprospecting, arthropods, insects, Guanacaste Conservation Area, Costa Rica, collecting methods, Santa Rosa, Guanacaste, Rincón de la Vieja, National Parks.

La bioprospección es una actividad de naturaleza exploratoria, no destructiva, en la que a través de la investigación científica, se pretende la obtención información útil derivada de la recolecta de cantidades mínimas de material biológico-genético, para lograr una aplicación de uso en medicina, agricultura y la industria (Sittenfeld y Lovejoy 1996, Sittenfeld 1999, Setzer et al. 2003). Ejemplos de bioprospección son la búsqueda de nuevos compuestos químicos a partir de plantas, microorganismos u otros seres vivos para su uso farmacéutico o agrícola (Sittenfeld 1996).

Tradicionalmente, el énfasis en la búsqueda de nuevos productos naturales para su uso en medicina se ha centrado en plantas, microorganismos y organismos marinos (Tamayo et al. 1997, Demain 1998). A pesar de que los artrópodos son un grupo con alta diversidad biológica, han recibido poca atención como fuente potencial de nuevos productos farmacéuticos. Lo anterior es debido a dificultades en la recolecta, la identificación taxonómica, el reducido conocimiento sobre su historia natural y la escasa información disponible sobre el análisis químico y farmacológico para la detección de compuestos de interés (Sittenfeld et al. 1999). Los insectos producen y utilizan una gran diversidad de sustancias activas, entre ellas, feromonas, compuestos de defensa y reguladores de crecimiento y diferenciación. Se ha observado gran variabilidad en las sustancias defensivas, tanto a nivel inter-específico como intra-específico. Asimismo, estas sustancias pueden variar dependiendo del sexo, edad, casta, estadio, raza, estación del año, población o la evolución del mecanismo de secreción, además de la dieta de los individuos, lo cual adiciona aún mayor variabilidad a su química (Barboza y Letourneau 1988, Weiss y Eisner 1998). En algunos casos, la producción de sustancias activas derivan de la interacción con microorganismos, como es el caso de la producción de feromonas producidas por bacterias que habitan en el intestino de insectos (Moreno 1997, Dillon et al. 2000, Stipeller et al. 2000, Sittenfeld et al. 2002).

Se estima que en Costa Rica existen aproximadamente 366 000 especies de artrópodos, de las cuales, 67 000 son conocidas (Obando 2002). En particular, Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera y Diptera son los órdenes con mayor número de especies (De La Fuente 1994), lo que podría significar una gran diversidad de nuevos compuestos de utilidad.

La búsqueda de nuevos productos farmacéuticos a partir de insectos y otros artrópodos, comprende la recolecta del material biológico y la producción de extractos químicos a partir de los artrópodos, sus partes o materiales asociados. Posteriormente, estos extractos son analizados en ensayos biológicos que permiten detectar nuevas actividades biológicas. Los principios bioactivos son purificados y caracterizados a partir del fraccionamiento guiado por bioensayo (Sittenfeld et al. 1999, Mateo et al. 2001). En el caso de compuestos de interés farmacéutico, estos son analizados por su potencial tóxico y sus aplicaciones clínicas en un proceso que puede tomar más de 10 años y con un costo de cientos de millones de dólares (Thayer 1998, Mateo et al. 2001). Este trabajo describe los resultados y los aspectos prácticos relacionados con la recolecta de artrópodos para la bioprospección, como parte del programa de Grupos Colaborativos Internacionales en Biodiversidad (Rosenthal 2002).

La recolecta de muestras de artrópodos se realizó entre 1994 y 1998 (hasta mayo), durante todos los meses del año, en el Área de Conservación Guanacaste (ACG), ubicada en el noroeste de Costa Rica (http://www.acguanacaste. ac.cr). El ACG cubre gran parte de un rectángulo definido por 10º44’ y 11º06’ latitud N por 85º15’ y 86º00’ longitud oeste (Janzen 1998) y tiene una extensión de 110 000 ha en la sección terrestre y 43 000 ha en la marina que alberga una gran diversidad de organismos y ecosistemas que varían desde bosque seco, bosque húmedo del Pacífico hasta bosque nuboso en las tierras altas y bosque lluvioso del Atlántico. Las muestras se recolectaron en 21 localidades que incluyen la mayoría de los ecosistemas del ACG.

Las muestras recolectadas se analizaron en las siguientes áreas terapéuticas: enfermedades parasitarias e infecciosas, cáncer, enfermedades del sistema nervioso central y cardiovascular, dermatología e inmunología (Sittenfeld et al. 1999).

Se consideró una muestra de artrópodos como un grupo de individuos de la misma especie, estadio y sexo, que provenía de la misma localidad y cuyo peso fresco mínimo estaba entre 6 y 10 g. Materiales asociados como estiércol, panales o mudas fueron también considerados como muestras. Estudios preliminares estimaron que este peso era apropiado para el análisis químico y los ensayos biológicos (Sittenfeld et al.1999). La muestra podía ser de una ecoespecie, que es un grupo de individuos de la misma especie y estadio de vida (adulto o inmaduro), o sexo, alimentándose de alguna otra de las plantas hospederas, o recolectados en otro sitio ecológicamente diferente. Por lo tanto, grupos de artrópodos adultos de la misma especie recolectados en localidades diferentes se consideraron como muestras distintas cuando los sitios presentaban diferencias altitudinales, climáticas, faunísticas y florísticas. De la misma manera, se estableció que si grupos de artrópodos inmaduros de la misma especie y estadio se encontraban en plantas hospederas distintas, serían analizados como muestras separadas. Para cada muestra de artrópodos se conservaron varios testigos de referencia, ya sea en colección húmeda (en alcohol 70% y constituida principalmente por individuos inmaduros) o montados en alfiler en el caso de los adultos. Esta colección de referencia forma parte del Inventario de Biodiversidad del Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio), Santo Domingo de Heredia, Costa Rica.

Para cada muestra se registró la información de la recolecta y comentarios sobre historia natural y ecología del artrópodo al momento de la recolecta.

Los artrópodos se recolectaron en el campo en bolsas plásticas separadas, una bolsa por sexo. Luego se verificó la identificación taxonómica, el sexo y el estadio. Después se transfirieron a recipientes de vidrio debidamente etiquetados y se almacenaron en congeladores (-20°C) mientras se completaba el peso final de la muestra. No se recolectó de nuevo una muestra excepto cuando resultó positiva en algún bioensayo.

Se seleccionaron aquellos métodos de recolecta en los cuales no se mezclan especies o sexos durante la captura, ya que algunos insectos cuando son perturbados tienden a producir sustancias defensivas que "contaminan" a todo el grupo, impidiendo la separación posterior de especies o sexos. No se usaron métodos de recolecta tradicionales que utilizan solventes químicos como parte de la captura. Los métodos de recolecta utilizados fueron los siguientes: recolecta manual, trampa de luz, crianza de artrópodos, trampa de foso, red de golpe, red acuática y red aérea (Nielsen 2003). Uno de los métodos de crianza utilizados, consistió en la localización de grupos de larvas en el campo, que fueron cubiertos con una malla, para evitar la depredación por pájaros. Cada grupo se revisó periódicamente para obtener muestras de diferentes estadios.

Se recolectó un total de 1800 muestras de artrópodos de 642 especies distribuidas en 21 órdenes y 95 familias. El 96.6% de las muestras fueron insectos y el 3.4% otros grupos de artrópodos como Araneae, Iulida, Opiliones, Polydesmida y Amblypygi. En el 75% de las recolectas, se obtuvo el peso fresco requerido de una muestra. Un total de 1 357 muestras alcanzaron la cantidad de extracto necesaria para ser analizadas en uno o varios bioensayos. Los sistemas de muestreo seleccionados fueron adecuados para la generación de muestras de artrópodos para procesos de bioprospección. En general, el tipo de muestreo utilizado permitió la exploración de diferentes sitios, tipos de clima, métodos de recolecta y principalmente la disponibilidad de artrópodos. Esto ofreció la oportunidad de escoger y/o cambiar la duración de la recolecta por localidad y movilizarse a otros sitios con mayor cantidad de artrópodos, situación que se hubiera dificultado con otro tipo de muestreo tal como el sistemático. Lo que ayuda a disminuir la interferencia de las dinámica de las poblaciones naturales.

En promedio se recolectaron dos muestras por especie de artrópodo (s=3.32, N=578). En 372 casos, se recolectó una muestra por especie; en 98, 32 y 24 casos se generaron dos, tres y cuatro muestras de la misma especie, respectivamente. La duración promedio de la recolecta de una muestra fue de 12 días.

El número de muestras de artrópodos recolectadas varió a través del año. La mayor cantidad de muestras se recolectó en la estación lluviosa (Fig. 1), cuando hay una mayor disponibilidad de recursos alimenticios para los artrópodos y por ende, una alta aparición de organismos. Son frecuentes las emergencias explosivas de órdenes como Lepidoptera y Coleoptera. En las tierras altas del ACG (Pailas, Santa María, Cacao, Góngora, Orosí, Pitilla, San Ramón, San Cristóbal, Teodoro, Campana, Pasmompa y San Josecito), la estación lluviosa se extiende desde finales de abril hasta enero, mientras que en las tierras bajas del ACG (Santa Rosa, Centeno, Jenny, Naranjo, Horizontes, Murciélago, El Hacha, Los Almendros y El Amo) se inicia a finales de mayo y finaliza en noviembre.

Se registraron variaciones en la recolecta de artrópodos en los diferentes meses y años del estudio. Durante 1994 se presentó un rango de alta aparición de artrópodos (meses en donde se recolectaron individuos de especies con potencial de obtener muestras entre 6 y 10 g) entre mayo y julio, y dos picos de recolecta (mes en donde se inició la mayor cantidad de muestras): uno en junio y otro en octubre, (Fig. 1). Durante junio de este año, los órdenes de insectos más recolectados fueron: Lepidoptera, Coleoptera y Orthoptera, y en octubre: Lepidoptera, Orthoptera e Hymenoptera. En 1995 también se presentó un rango de alta aparición entre mayo y julio. El mes donde se recolectaron más artrópodos fue en junio, siendo los principales grupos: Orthoptera, Lepidoptera y Coleoptera. Para el año 1996, se registra el número más alto de recolectas y dos rangos de alta aparición: uno de abril a junio y otro de setiembre a octubre. En abril y setiembre se dieron dos picos de recolecta; en ambos casos los grupos más recolectados fueron: Lepidoptera, Orthoptera y Coleoptera. Durante 1997 se dieron dos picos de alta aparición: uno de abril a junio y otro de octubre a noviembre. Mayo y octubre fueron los meses donde se recolectó la mayor cantidad de muestras; en mayo los principales grupos fueron: Lepidoptera, Hemiptera y Coleoptera, mientras que en octubre fueron: Lepidoptera, Coleoptera y Orthoptera.

Los promedios mensuales de precipitación de Santa Rosa (tierras bajas) y Orosí (tierras intermedias del ACG), más altos coinciden con las mayores cantidades de artrópodos recolectadas.

En 1997 se recolectaron 266 muestras de insectos, siendo el año en que hubo la menor cantidad de recolectas, debido a que el área de trabajo se limitó a las zonas bajas del ACG, ya que se trató de recolectar artrópodos que se alimentaban de frutos de árboles del bosque seco. Generalmente, eran artrópodos muy pequeños, por lo que fue difícil obtener muestras con un mínimo de 5 g. Otra causa del bajo número de muestras fue la precipitación, ya que este año se informa como uno de los más secos desde 1983 (debido al Fenómeno del Niño) y con las densidades de insectos más bajas que se han informado en toda la historia de la investigación del ACG (Sittenfeld et al. 1999). En 1997, el mes donde se recolectó la mayor cantidad de muestras fue junio (n=43), las cuales correspondieron principalmente a artrópodos de los grupos Lepidoptera y Coleoptera.

En los meses de mayor aparición de artrópodos durante este estudio, se recolectaron principalmente individuos de los grupos Lepidoptera, Orthoptera y Hemiptera. La aparición de estos grupos coincide con el inicio de las lluvias y el consecuente aumento en la disponibilidad de vegetación por ende de alimento para órdenes como: Orthoptera, Hemiptera, Homoptera, Lepidoptera, cuyos adultos emergen en esta época. Otros grupos que se recolectaron al inicio de la lluvias fueron: Hymenoptera (avispas, abejas) y Polydesmida (milpiés). Hymenoptera fue un grupo muy activo durante la estación lluviosa, ya que hay muchas plantas en floración y sus adultos se alimentan de polen y néctar. Los representantes del orden Polydesmida se alimentan de materia orgánica en descomposición y son también muy abundantes en esta época del año.

El porcentaje de las muestras recolectadas por orden fue el siguiente: Lepidoptera 49.72%, Coleoptera 15.75%, Hymenoptera 13.33%, Orthoptera 11.43%, Hemiptera 6.75%, Homoptera 3.20% y otros grupos 7.89%. En la categoría Otros se encuentran 13 órdenes, entre los principales están: Araneae, Diptera, Amblypygi, Isoptera, Iulida, Neuroptera, Odonata y Thysanoptera, los cuales contribuyeron con el aumento de la variabilidad de muestras. En el orden Lepidoptera se recolectaron 212 especies (572 muestras), en Coleoptera 121 especies (182 muestras), en Hymenoptera 42 especies (154 muestras), y en Orthoptera 63 especies (132 muestras).

El porcentaje de las muestras recolectadas por estadio fue el siguiente: adultos 54.26%, larvas 19.90%, estiércol 11.20%, pupa 6.46%, prepupa 6.12%, ninfas 2.07% y otros estadios 3.74%. Las muestras de estiércol provenían de las bolsas de crianza.

Las especies de insectos con un mayor número de muestras recolectadas fueron: Rothschildia triloba (Saturniidae) con 32 muestras, Agelaia sp. (Vespidae) con 31, Polybia diguetana (Vespidae) con 30 muestras, Automeris postalbida (Saturniidae) con 27, lo que indica que es posible obtener un número alto de ecoespecies en el grupo de los artrópodos.

En el Cuadro 1 se incluye la lista de artrópodos recolectados en esta investigación así como las plantas asociadas a cada muestra. Algunos datos corresponden a nuevos informes, tal como Pachygonidia ribbei (Saturniidae), recolectada en el Sector Santa María alimentándose de Hamelia patens (Rubiaceae), la cual fue un nuevo informe de localidad y planta hospedera, al momento de la recolecta. Se identificaron 124 especies de plantas hospederas asociadas con los insectos recolectados, las cuales corresponden a 69 familias diferentes y 145 especies. El 82.50% de las especies de plantas que se identificaron se informan como hospederas del grupo Lepidoptera. El porcentaje restante correspondió a plantas en las que se encontraron artrópodos de los órdenes: Coleoptera (9.39%), Hemiptera (4.97%), Homoptera (1.40%) y Orthoptera (0.37%); principalmente alimentándose de su savia, hojas o flores. Algunas especies de artrópodos también se encontraron copulando en estas plantas.

En el caso de los coleópteros, individuos de las familias Chrysomelidae, Curculionidae, Meloidae y Cerambycidae, se encontraron asociados a árboles, arbustos o hierbas, ya sea alimentándose de su follaje o en el interior de su tronco o tallo.

En los órdenes Hemiptera y Homoptera también se recolectaron organismos herbívoros, como insectos de las familias Membracidae (Homoptera), Aphrophoridae (Homoptera), Pentatomidae (Hemiptera), Coreidae (Hemiptera). Algunas especies de hemípteros son generalistas, como Pharypia pulchella (Pentatomidae) que se recolectó alimentándose en 7 plantas diferentes: Genipa americana (Rubiaceae), Picramnia sp. (Simaroubaceae), Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae), Mouriri myrtilloides (Melastomataceae), Randia subcordata (Rubiaceae), Tetracera volubilis (Dilleniaceae) y Serjania sp. (Sapindaceae). Por otra parte, otros hemípteros como Thasus sp. se encontraron alimentándose de Pithecellobium dulce (Fabaceae/Mimosaceae), mientras que dos miembros de la familia Pentatomidae:

En algunas plantas se recolectaron varias especies de artrópodos, tales como: Inga punctata (Fabaceae/Mim.) en la cual habían 7 especies de artrópodos; Enterolobium cyclocarpum (Fabaceae/Mim.) y Quercus oleoides (Fagaceae) con 6 especies en cada una y Persea americana (Lauraceae), Cordia alliodora (Boraginaceae), Guazuma ulmifolia (Sterculiaceae) y Prunus annularis (Rosaceae) con 5 especies.

Los métodos de recolecta de artrópodos más eficaces fueron aquellos que permitieron obtener muestras mayores de 5 g en el menor tiempo posible. El método más utilizado fue la recolecta manual (44.38%), seguido por crianza de insectos (25.73%), trampa de luz (18.80%), diferentes tipos de redes (10.52%) y otros métodos como la trampa de foso (0.16%). Las especies de artrópodos que alcanzaron el peso mínimo requerido para prospección presentaron una o varias de las siguientes características: eran abundantes, tendían a agruparse para alimentarse, reproducirse o simplemente posarse sobre alguna planta.

La recolecta manual permitió obtener información sobre la historia natural de los artrópodos recolectados. Los principales grupos recolectados fueron: Lepidoptera (27.47%), Hymenoptera (24.40%) y Coleoptera (19.03%); también se recolectaron otros grupos tales como: Hemiptera (7.18%), Orthoptera (6.64%) y Polydesmida (3.60%). Los lepidópteros recolectados manualmente corresponden a estadios larvales; en Hymenoptera la recolecta más frecuentes fue de panales (nidos), adultos y sus estadios; en Coleoptera este porcentaje se refiere a los fitófagos (adultos) y a las larvas y/o adultos que se alimentan de madera, principalmente. El 48.83% de los organismos recolectados manualmente eran adultos y el 31.40% correspondió a diferentes estadios larvales. El 20% restante eran prepupas, pupas, ninfas en diferentes estadios y otros materiales (panal, ootecas, etc.). La recolecta manual se consideró un método efectivo, en el cual se invierte mucho tiempo pero con muy buenos resultados, ya que se obtuvo 557 muestras de 289 especies.

El 25.73% de las muestras se obtuvo mediante crianza y de éstas, el 98% pertenecen al orden Lepidoptera, 1.23% y 0.62% a los ordenes Hymenoptera y Coleoptera, respectivamente. La mayor cantidad de muestras del orden Lepidoptera correspondió a estiércol (36.84%), diferentes estadios larvales (32.51%), prepupas (17.03%), pupas (11.76%) y material asociado como las mudas (1.24%). Mediante este método se recolectaron muestras provenientes de 117 especies de artrópodos, de las cuales se logró obtener un total de 323 muestras. En general, el orden Lepidoptera se puede criar fácilmente ya que algunos hospederos eran conocidos en el área de estudio y presentaban estadios inmaduros reconocibles e incluso identificables a nivel de especie y tenían un peso fresco relativamente alto. Unos pocos individuos podían completar una muestra, pero como tenían una alta cantidad de agua, fue necesario aumentar el peso fresco recolectado en estos casos (Sittenfeld et al. 1999). El estiércol de cada estadio larval también se analizó, diversificando el número de muestras de la misma especie.

Con la trampa de luz fue posible recolectar ambos sexos de la misma especie. Lo anterior aplica para la mayoría de los ordenes, excepto para Lepidoptera donde más del 90% de los individuos que llegan a las luces son machos. Sin embargo, se recolectaron algunas hembras grávidas de hospederos conocidos que se utilizaron para criar las larvas que eclosionan de sus huevos. De una hembra se pudieron obtener varias muestras, como es el caso de las especies polífagas.

Con las redes (aérea, de golpe y acuática) se recolectaron 132 muestras de 91 especies. El 10.52% de las muestras, principalmente de los órdenes Orthoptera (26.50%), Hemiptera (21.97%), Coleoptera (16.67%), Hymenoptera (9.85%) y Lepidoptera (9.09%). También se utilizaron otros métodos de recolecta de artrópodos (0.16%), entre los cuales se encuentra la trampa de foso, con carne o estiércol de caballo como cebos.

En 1997 y 1998, se enfatizó en la recolecta de muestras que resultaron positivas en diferentes ensayos biológicos. El proceso de investigación posterior es lento y por lo general requiere material adicional, para efectuar el aislamiento y caracterización de un compuesto activo. A la fecha los primeros resultados de los bioensayos se han informado para actividad antiparasitaria (Chinchilla et al. 2003).

Este estudio aporta nueva información sobre la recolecta de artrópodos para prospección que puede ser útil para países que cuentan con una alta diversidad biológica, al describir los sistemas de recolecta más exitosos y congruentes con la utilización del recurso de una manera sostenible. Los datos biológicos y químicos constituyeron el valor agregado de la muestra, ya que no es solamente un extracto crudo de material biológico, sino un conjunto de información clave que guía un proceso de investigación y de conservación. Esta información podría ser de importancia para la determinación de la fuente del compuesto activo y las condiciones bajo las cuales se produce.

En los estudios de bioprospección de artrópodos se debe evitar la recolecta intensiva durante varios años consecutivos en la misma localidad y procurar la recolecta de la menor cantidad posible de indivuduos, evitando, la alteración de las poblaciones silvestres de artrópodos. Debido a que la dinámica de la mayoría de sus poblaciones no ha sido ampliamente estudiada, es preferible recolectar especies de las cuales se tenga información básica para evitar daños posteriores. Se recomienda minimizar la interferencia en procesos vitales de los organismos tales com reproducción, comportamiento y alimentación. Es necesario escoger la época del año adecuada, permitir el restablecimiento natural de las poblaciones y ser cuidadoso con la extracción masiva de hembras. La bioprospección de artrópodos es posible, si se diseñan prácticas de recolecta que no alteren procesos fundamentales de los organismos, así como interacciones entre organismos en los ecosistemas.

Agradecimientos

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Resumen

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