0001-6002 0001-6002 S0001-60022008000500005 00 11 2008 00 11 2008 50 13 15

Cuantificación del virus de hepatitis B por la técnica PCR  tiempo real

Quantification of viral hepatitis type B using the real-time PCR technique

Elizabeth Rojas-Cordero*+

Resumen: La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha determinado, en la cuantificación de virus, un avance especial para el manejo de infecciones crónicas por virus, en especial, para HIV, virus de hepatitis B y C. La cuantificación en tiempo real se realiza en el ABI PRISM Sequence Detection System. Se amplifica, específicamente, el fragmento pb del genoma del virus de hepatitis B. Se recomienda el HBV PCR kit para la toma de la muestra., determinándose un protocolo para el almacenamiento de la misma. Es importante saber que el congelar las muestras o el almacenamiento prolongado disminuyen la sensibilidad del método. Se puede almacenar por años si es a una temperatura de – 70º C. Tubos con heparina o pacientes heparinizado alteraran la determinación de la muestra. El limite inferior detectable del virus B es de 3.78 UI/ml y el mayor es 1.4 x 10¹¹ UI/ml, se determinan todos los genotipos desde A-H. Los pacientes HBeAg positivos, usualmente, tienen valores mayores a 1 x 106 UI/ml y los HBe negativos portadores inactivos por lo general, valores menores a 1 x 104.
]]> Descriptores: HBV PCR, ABI PRISM 700 Sequence Detection System.

Abstract: The polymerase chain reaction technique (PCR) has determined a special advance in the virus quantification for the management of chronic viral infections, especially for HIV hepatitis virus type B and C. The real-time quantification is performed in the ABI PRISM Sequence Detection System. The fragment pb of the genome of the hepatitis type B virus is amplified. The HBV PCR kit is recommended for taking a sample and a protocol for storing it is determined. It is important to know that freezing the samples or keeping them for a long time decreases the sensitivity of the method. It may be stored for years if kept at a temperature of -70° C. Heparinized patients or tubes with heparin will alter the determination of the sample. The lower limit of detection of B virus is 3.78 Ul/ml and the higher limit is 1.4 x 1011 Ul/ml. All genotypes from A-H are determined. The patients with HbeAg positive usually present higher values than 1 x 106 Ul/ml and the HBe negative inactive carriers usually get lower values than 1 x 104.

Key words: HBV PCR, ABI PRISM 700 Sequence Detection System.

Se define como carga viral (CV) en número de copias de ARN o ADN de un virus que se encuentra presente en una muestra. La determinación cuantitativa del ADN del virus hepatitis B (VHB) es importante en el seguimiento y el tratamiento de pacientes con infección crónica por el virus.

El ADN del VHB en suero o plasma puede cuantificarse mediante la amplificación del ácido nucleico o por tecnologías de amplificación de señal. El ensayo Abbott Real Time HBV utiliza la tecnología de PCR (reacción en cadena de polimerasa) junto con la detección de fluorescencia homogénea en tiempo real para la cuantificación del ADN del VHB. La selección de una región altamente conservada en el gen de superficie permite la detección de los genotipos A-H. La localización de la región diana en el tercio N terminal del gen de superficie garantiza que el ensayo no se vea afectado por los mutantes YMDD, los mutantes de escape del HbsAg o los mutantes resistentes a los fármacos, ya que esta región es imprescindible para la unión y secreción de partículas subvíricas y tolera solo cambios estructurales mayores.

El ensayo Abbott Real Time HBV utiliza PCr para generar producto amplificado del genoma ADN del virus en muestras clínicas. Al comienzo de la preparación de la muestra se introduce una secuencia de ADN no relacionado con la secuencia diana de la muestra del VHB a cada muestra.

Esta secuencia no relacionada de ADN se amplifica simultáneamente por PCR y sirve como control interno (IC) para demostrar que el proceso se ha realizado correctamente para cada muestra. La cantidad de secuencia diana del VHB presente en cada ciclo amplificación se mide mediante el uso de oligonucleótidos marcados con fluorescencia hibridados específicamente al producto amplificado. El ciclo de amplificación realizado por el sistema Abbott m 2000 rt detecta una señal fluorescente que es proporcional al Log de la concentración de ADN del VHB presentes en la muestra original.

Los resultados pueden ser reportados en Unidades Internacionales por mililitro (UI/ml) o Log UI/ml o bien copias por mililitro (copias/ml) o Log copias/ml. El factor de conversión es 1 UI=3.41 copias. El intervalo lineal del análisis es de 10 a 1 billón UI/ml

Recolección y almacenamiento y transporte de muestras, el análisis de carga viral de HCV, HBV y genotipaje HCV.

]]> 1-Muestras de plasma humano, recogidos con EDTA a ACD con un mínimo de 2.3ml (2 tubos morados).

2-Las muestras se pueden almacenar de la siguiente manera:

Antes de centrifugar:

15°C-30°C ---Hasta 6 horas

2°C-8°C—Hasta 24 horas

Después de centrifugar:

15°C — 30°C ---Hasta 24 horas

2°C — 8°C ---Hasta 5 días

Velocidad de centrifugación: 2000g (4400 r.p.m) por 5 minutos

3-Para el almacenamiento prolongado se recomienda temperaturas de -20°C o inferior:

]]> 4-Evitar someter las muestras a múltiples ciclos de congelación y descongelación, máximo 3 veces antes de procesar.

5-Se recomienda la separación de muestras en cámara de flujo laminar.

6-Se recomienda utilizar puntas de pipeta estériles, con filtro y libres de RNAsas.

7-Se recomienda separar el plasma en tubos estériles de polipropileno y etiquetar según lo establezca la norma (nombre, número de muestra y clave).

8- Utilizar guantes libres de polvo y estériles.

9-El trasporte de la muestra debe ser en frió y cumplir con las normativas que rigen al trasporte de muestras clínicas, agentes etiológicos y sustancias infecciosas.

10-Las muestras deberán venir debidamente rotuladas con la letra clara y en marcador indeleble.

Lecturas recomendadas

Lok Anna McMahon: AASLD. Guideline: Chronic Hepatitis B. En: http://www.cdc.gov/NCIDOD/DISEASES/HEPATITIS/b/aasld_ update_chronichep_b.pdf.         [ Links ]

Lok Anna: Clinical manifestations and natural history of hepatitis B virus infection: En: http://www.uptodate.com/patients/content/topic. do?print=true & topicKey=heptitis/10144 & view=print         [ Links ]

Lok Anna: Serologic diagnosis of hepatitis B virus infection. En: http://www.uptodate.com/patients/content/topic.do?topicKey=heptiti s/9842         [ Links ]

Eng-Kiong Teo, Lok Anna. Epidemiology transmission and prevention of hepatitis B virus infection. En: http://www.uptodate.com/patients/ content/topic.do?topicKey=~YdsBBTKUaUagCfn         [ Links ]

Chin-Jen Chu, Lok Anna: Clinical significance and molecular characteristics of common hepatitis B virus variants. En: www.aacr. org/PDF_files/2005am/2005_Final_Program2005%20AACR%20 Program%20257-357%20Tuesday.pdf.         [ Links ]

E . Keeffe , S . Zeuzem , R . Koff , D . Dieterich , R . Esteban–Mur , E . Gane et al. Report of an International Workshop: Roadmap for Management of Patients Receiving Oral Therapy for Chronic Hepatitis Clin Gastroenterol Hepatol 2007;5: 890-897.         [ Links ]


]]> *Laboratorio de Biología Molecular, Hospital San Juan de Dios.

Abreviaturas: PCR, reacción en cadena de la polimerasa; IC: control interno.

]]> 2007 5 890-897