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INTRODUCCIÓN
En el Perú la población infantil y adolescente es afectada por la caries dental en una alta frecuencia, superando el 90% de afectación. La prevalencia en el área urbana es de 90,6% y en la rural 88,7%. El promedio de piezas cariadas, perdidas y obturadas en la dentición temporal y permanente (índice ceo-d/ CPO-D) a nivel nacional es de 5.84 y el promedio de piezas cariadas, perdidas y obturadas en la dentición permanente para la edad de 12 años (CPO-D-12) a nivel nacional es de 3.67 (IC95%: 3,37-3,97) 1).
La caries dental es un proceso patológico infeccioso, multifactorial, localizado y transmisible que destruye los tejidos duros dentales. 2 En términos ecológicos, esta enfermedad es consecuencia de un desequilibrio en el ecosistema oral que lleva al predominio de una flora antes considerada normal en cavidad oral y ahora convertida en patógena 3).
Los principales microorganismos asociados con la producción de caries son, en orden de frecuencia: 1° Streptococcus mutans (principalmente el serotipo C), y en menor proporción Streptococcus sobrinus y Streptococcus gordonii; y dos especies de Lactobacillus y Actinomyces2).
La presencia de Streptococcus mutans en la iniciación de la caries dental se debe a su potencial acidogénico y ácido 4)(5. El Streptococuus mutans sintetiza un polisacárido de matriz extracelular en biopelículas dentales, por acción de las enzimas extracelulares denominadas glucosiltransferasas, que constituyen un factor de virulencia significativa en el inicio de la caries dental. Estas glucosiltransferasas se clasifican de acuerdo a su solubilidad en agua del glucano y estas son la gtfB, gtfD y gtfC, esta nomenclatura está basada en el nombre que recibe el gen que lo codifica a cada una de las enzimas. Estos exopolisacáridos proporcionan sitios de unión que promueven el establecimiento de biofilm patógenos 6)(7.
Los datos relacionados a la distribución y prevalencia de los serotipos de Streptococcus mutans son limitados. En Japón, la prevalencia de los serotipos de Streptococcus mutans en muestras orales es principalmente el serotipo c (76%), seguido del serotipo e (26%), el serotipo f (8%) y el serotipo k (2-5%) 8)(9).
Pieralisi F. et al.10 evaluó la diversidad genotípica de Streptococcus mutans en niños preescolares libres de caries y caries activas en Brasil. Se encontró una fuerte asociación entre la diversidad genotípica y la experiencia de caries (r=0,72; P<0,001). Entre los niños con más de un genotipo, 13 tenían caries dental (2 a 5 genotipos) y 4 libres de caries (sólo 2 genotipos). Estos resultados apoyan los hallazgos previos de la diversidad genética de Streptococcus mutans en niños preescolares que se asocian con la caries dental.
Cheon K. 11 evaluó la diversidad, comunalidad y estabilidad de los genotipos de Streptococcus mutans asociados a caries dental. Se aislaron 18 genotipos, de los cuales 13 genotipos fueron compartidos por al menos dos niños. El número de genotipos por niño estuvo positivamente asociado con la proporción de superficies cariadas. Se presume que la menor cantidad de superficies cariadas están significativamente asociadas con una menor diversidad y mayor estabilidad de genotipos de Streptococcus mutans.
Arévalo et al.12) encontró en niños de 6 y 7 años una prevalencia de Streptococcus mutans del 14,9%. De las 47 muestras de saliva, 57,4% (27)correspondieron a niños con caries dental, y de ellas 8,5% 4), fueron positivas para Streptococcus mutans genotipo c, 2,1% (1 cada una) genotipo f, genotipo k, genotipo c y k respectivamente.
Argandoña R. et al.13 no encontró diferencias en la diversidad genotípica y en la acidogenicidad de los genotipos entre niños sin caries y niños con caries de la primera infancia y niños con una o más cavitaciones. Aunque la diversidad genotípica de Streptococcus mutans fue similar entre los grupos de niños, los rasgos fenotípicos de Streptococcus mutans, especialmente la respuesta de tolerancia ácida, podría explicar la gravedad de la caries en la primera infancia.
En la comunidad científica hay consenso en señalar al Streptococcus mutans como el microorganismo más importante en caries dental. Por lo tanto, las estrategias de aislamiento, identificación, tipificación, prevención y control se dirigen principalmente hacia él.
La alta incidencia que presenta esta enfermedad bucal, así como la gran necesidad de prevenirla, motivó el desarrollo de esta investigación, cuyo propósito fue determinar la presencia del genotipo C en el Streptococcus mutans en niños y adolescentes peruanos, utilizando la técnica PCR- Multiplex; y su asociación con la prevalencia de caries dental. De este modo se podrá enfocar esfuerzos para su prevención y el control de su proliferación, antes que se produzca lesiones de caries.
MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO Y POBLACIÓN DEL ESTUDIO
La población estuvo conformada por niños y adolescentes entre 8 y 15 años pertenecientes a tres instituciones educativas de tres distritos de Lima. La muestra se obtuvo con un nivel de confianza de 95%, proporción esperada de 0,94 y precisión de 0,05 dando un total de 78 niños. No fueron considerados para este estudio los niños que no presenten al menos una lesión de caries dental en boca, que presenten enfermedades sistémicas que alteren las características de la saliva y la flora oral. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Código de proyecto No 0422).
EVALUACIÓN DIAGNÓSTICA Y TOMA DE MUESTRA
La identificación de caries se realizó a través de un examen clínico intraoral para examinar el número de piezas cariadas, obturadas o extraídas, basándonos en los criterios de la OMS.
La saliva estimulada fue colectada por espacio de tres minutos, en frascos estériles de boca luego de más de una hora sin haber tomado alimento alguno de haber masticado una cápsula de parafina. La saliva fue almacenada a 4ºC y procesada dentro de las siguientes dos horas.
CULTIVO BACTERIANO: DETECCIÓN DE STREPTOCOCCUS MUTANS EN MUESTRAS DE SALIVA HUMANA
Se preparó una batería de diluciones de la muestra de saliva humana en agua peptonada, se consideraron las diluciones 100 (inoculación directa de la muestra) ,10-2 y 10-4, y se inoculó en medio selectivo Mitis Salivarius con Bacitracina y Sulfisoxasol. En el caso de la inoculación directa de la muestra, ésta se hizo con el aza de cole y en el caso de las demás diluciones se procedió a sembrar en superficie y dispersar con espátula de vidrio estéril 100 µl.
Se procedió a incubar entre 48-72h en condiciones anaeróbicas a 37ºC. Las colonias que cumplían los criterios morfológicos fueron aisladas, sometidas a prueba de catalasa y sometidas a observación microscópica con tinción de Gram.
Las colonias fueron colectadas en crioviales con caldo BHI con 10% de glicerol y se almacenaron a -20ºC. Aquellas en las que no hubiese suficiente biomasa, se requiriese mayor aislamiento o hubiese dudas en las pruebas de identificación se replicaron en Medio selectivos Mitis Salivairius modificado 14).
ANÁLISIS MOLECULAR
El DNA bacteriano para la amplificación con PCR, fue extraído utilizando el kit DNeasyR Blood y Tisue (Qiagen, Germantown, USA).
La diferenciación entre Streptococcus sobrinus y Streptococuus mutans, se realizó utilizando una PCR multiplex 2). Dos pares de cebadores amplificadores gtfI y genes Bft para S. sobrinus y S. mutans, respectivamente. Cada mezcla de PCR contenía 16 mM (NH4) 2SO4,67mM de tris-HCI (pH8,8),0.01% de Tween-20,1, 5mM de MgCI2, 0, 5 uM de cada oligonucleótido cebador, 0,2mM de cada dNTP (Bioline, Londres, Reino Unido), UK) y 50-100 ng de DNA. Las muestras se amplificaron en un termociclador (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) en las siguientes condiciones de PCR, la desnaturalización inicial se realizó a 96º C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95º C durante 30 segundos, recocido a 59º C durante 30 segundos y extendido a 72ºC por 1 minuto.
ELECTROFORESIS
Los productos de la amplificación de los PCR multiplex fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5% preparado en el tampón TBE 1X, en una cámara de electroforesis COMPACT XS/S BIOMETRA®. Como marcador de peso molecular se utilizó 1µL de 100 pbLadder DNA marker Geneon para determinar el tamaño de las bandas correspondientes a los genes. Para la observación de las bandas de ADN se utilizó un Transiluminador de luz ultravioleta UVSTAR 312nm, BIOMETRA.
GENOTIPIFICACIÓN DE STREPTOCOCCUS MUTANS
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO
Para la extracción de ADN se utilizó el GF-1 Bacterial DNA Extraction Kit de GeneONGmbH para lo cual se realizó cultivos de las cepas de Streptococcus sp en el caldo BHI con sacarosa a 37ºC por 24 horas. Se obtuvieron 727 pares de bases con la secuencia que se observa en la tabla 1.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos fueron procesados en el programa SPSS versión 25. Se utilizó la prueba U de Mann Whitney para comparar la experiencia de caries según sexo, presencia de Streptococcus mutans y presencia de genotipo C. El nivel de significancia considerado fue 5%.
RESULTADOS
La muestra estuvo conformada por 78 niños y adolescentes, distribuidos equitativamente según sexo. La edad en el sexo masculino fue en promedio 12,41±3,41, y en el sexo femenino 12,49±3,07.
La prevalencia de caries dental en la muestra fue de 82,1% (64 de 78 sujetos). La experiencia de caries de la muestra fue 3,47±3,19, siendo en el sexo femenino mayor en comparación al sexo masculino.
Se encontró presencia de Streptococcus mutans en el 75,6% de la muestra (59 de 78 sujetos), no encontrándose diferencias estadísticamente significativas en el CPODceod entre los que presentaron y no presentaron Streptococcus mutans.
En los 59 niños y adolescentes que presentaron Streptococcus mutans se identificaron 22 pertenecientes al genotipo C (figura 1). No encontrándose diferencias estadísticamente significativas en cuanto su distribución según el sexo X2= 0,192 p= 0,789.
La experiencia de caries dental no presentó diferencias estadísticamente significativas entre los sujetos que presentaron y no presentaron el genotipo C (Tabla 2).
Tabla 1 Análisis de Genotipificacion.
| Sistemas | Genes | Indicadores | Secuencia (5'→3') | Producto PCR | Referencia |
|---|---|---|---|---|---|
| PRC | rgpH | SC-F SC-R | CGGAAGTGCTTTTTACAAGTGCTGG AACCACGGCCAGCAAACCCTTTAT | 727bp | Arévalo et al 2014 |
Tabla 2 Experiencia de caries total según sexo, presencia de Streptococcus mutans y genotipo C presente en la muestra.
| Experiencia de caries total (CPOD-ceod) | ||||
|---|---|---|---|---|
| - | N | Media | DS | p |
| Sexo | - | - | - | - |
| Masculino | 39 | 2,92 | 3,3 | U= 0,545 |
| Femenino | 39 | 4,03 | 3,01 | 0,03 |
| Streptococcus mutans | - | - | - | - |
| Ausente | 19,5 | 3 | 2,21 | U= 548 |
| Presente | 59 8 | 3,63 | 3,44 | 0,88 |
| Genotipo C | - | - | - | - |
| Presente | 22,5 | 3,36 | 3 | U= 389 |
| Ausente | 37 | 3,86 | 3,75 | 0,782 |
DISCUSIÓN
La caries es una de las enfermedades de naturaleza infecciosa crónica transmisible, muy prevalente en el Perú y el mundo, relacionada a la presencia del S. mutans1).
El ministerio de salud (MINSA) 1 realizó un estudio en el año 2005, en 24 departamentos, la prevalencia en el área urbana fue 90,6% con un promedio (índice ceo-d/ CPO-D) a nivel nacional fue de 5.84, valores mayores a los encontrados en el presente estudio.
En relación al sexo está investigación encontró mayor prevalencia en el sexo femenino, coincidiendo con autores como Oho T., 15). Sin embargo en otras investigaciones predominan el sexo masculino 16)(17 e incluso otros autores no encontraron ninguna asociación entre el sexo y la severidad de la caries dental 18)(19).
Sobre la presencia de Streptococcus mutans, empleando el PCR Multiplex, los resultados evidenciaron prevalencias mayores de Streptococcus mutans a la encontrada por Sánchez & Acosta 20 en niños de 8 a 10 años de edad: 32%, y a las de Arévalo et al.12) que encontraron una prevalencia de 14,9%. Salazar et al.19) encontraron prevalencias mayores (88,2%) en escolares de 5 a 17 años.
Se encontró una relación positiva entre caries dental y Streptococcus mutans en 12 estudios realizados por Graciano 21), la presencia de Streptococcus mutans parece estar relacionada con la producción de caries y con factores socioculturales. Gispert 22 plantea que existe correspondencia entre el grado de infección y la actividad de caries, por lo que un estudio de este tipo se considera de estimable valor en el pronóstico de riesgo a caries. Sánchez & Acosta 20 encontraron que el 80% de los Estreptococos correspondieron al grupo mutans, no se demostró asociación entre bacteria predominante e incidencia de caries.
En este estudio de genotipificación por PCRMultiplex se identificó 22 muestras de saliva con genotipo C, que de acuerdo a la solubilidad de la glucosiltransferasa es mixta y que está en relación con la virulencia del Streptococcus mutans23), nuestro resultado no guarda relación directa con la incidencia de caries en la población de estudio.
La presencia de Streptococcus mutans de genotipo C en el presente estudio fue de 37,29%. Gamboa 2 manifiesta que el principal microorganismo asociado con la producción de caries es Streptococcus mutans principalmente del serotipo C. Arévalo et al 12 encontraron que la prevalencia de S. mutans tipo C fue de 8,5 %, frecuencia mucho menor a la encontrada en el presente estudio.
