Metodología

Para el diseño de la metodología de cuantificación de los metales pesados Cu, Fe y Zn, se tomó como referencia los siguientes métodos:

AOAC Official Method 967.08. Copper in Destilled Liquors (Atomic Absorption Spectrophotometric Method)

AOAC Official Method 970.12. Iron in Destilled Liquors (Atomic Absorption Spectrophotometric Method)

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Metals by Flame Atomic Absorption Spectrometry (3111 B). Direct Air-Acetylene Flame Method.

Thermo Scientific Method Iron, Copper and Zinc Determination in Wine using Flame Atomic Absorption Spectroscopy.

Los métodos de la AOAC fueron considerados para definir únicamente la concentración mínima de la curva de calibración, asimismo, del Standard Methods se tomó el procedimiento para probar el proceso de digestión ácida, y el método (no oficial) de Thermo Scientific fue empleado como la metodología base a seguir; de igual forma, se tomó en consideración las concentraciones expuestas en este para definir el rango lineal de trabajo óptimo del nuevo método a desarrollar.

Para la determinación de las condiciones óptimas de trabajo, en primera instancia, se procedió a realizar una serie de ensayos preliminares para definir tanto los parámetros de partida del instrumento, como los rangos de concentración adecuados para los dos tipos de matriz en estudio, además, se verifica si es posible la cuantificación de los metales preparados de manera conjunta (mezclados).

Con respecto a la optimización de la altura del quemador y el flujo del gas con cada elemento, se emplearon los estándares recomendados por el fabricante de Thermo Scientific (estándar de cobre de 3,5mg/L, estándar de hierro de 5mg/L y estándar de zinc de 1mg/L). Posteriormente, se mide en el equipo de absorción atómica el estándar de mayor concentración de manera individual y con los otros dos elementos, para determinar la variación en la señal al mezclar los tres metales implicados.

Una vez definidos los parámetros de partida del equipo, a partir de los estándares certificados de 1000mg/L se preparó una solución estándar de 10mg/L con los tres metales (Cu, Fe y Zn), la cual es diluida con ácido nítrico al 2%m/v en un balón de 200mL. De la madre de 10mg/L se preparan los patrones con concentraciones de 0,2 a 1,6mg/L.

Posteriormente, se realizó la medición de muestras para definir las concentraciones de analito presentes tanto en el agua como en el alcohol destilado y se procedió a validar los principales parámetros de desempeño del método, preparando tres curvas de calibración para evaluar la linealidad con el coeficiente de determinación arrojado en cada curva de calibración; asimismo, se evaluó el gráfico de residuales, y de manera cuantitativa mediante el test de linealidad para el coeficiente de correlación, la pendiente y el intercepto. Con respecto al criterio de precisión, se evaluó la repetibilidad, mediante seis réplicas de una muestra de agua, y seis de alcohol destilado para cada uno de los metales en estudio, las cuales han sido fortificadas con 1mg/L de cada metal, de esta manera, se evalúa el coeficiente de variación obtenido a partir de las seis réplicas analizadas. Además, se calificó la exactitud del método mediante la preparación de seis muestras enriquecidas y no enriquecidas para determinar el % de recuperación obtenido para cobre, hierro y zinc en las muestras de agua y el alcohol destilado. De igual forma, se toma en cuenta el sesgo obtenido, mediante el análisis de seis muestras fortificadas con 1mg/L, para determinar la veracidad de los resultados analíticos.

Análisis

Límite de detección (LOD), límite de cuantificación (LOQ) y ámbito lineal: Al comparar los coeficientes de correlación (Cuadro 1) se obtuvo que el rango lineal para el zinc se ve afectado por el estándar de 0,2mg/L. Aunque la respuesta lineal a esa concentración no decrece en el caso del cobre y el hierro, el zinc también excede el máximo de aceptación para el límite de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) (Cuadro 1). Por tal motivo se modificó el intervalo de trabajo de 0,4 a 1,6mg/L (ver Figura 1); tomando en consideración la concentración máxima permitida de los tres metales para ambos tipos de muestra, según lo refiere la norma NCR 126: 1991. Vodka y el Reglamento para la Calidad del Agua Potable vigente en Costa Rica.

Figura 1 Superposición de las curvas de calibración para el cobre. 

Evaluación de la digestión idónea para método: El Cuadro 2 evidencia la comparación del porcentaje de recuperación tanto en las muestras digeridas, como en las no digeridas para el alcohol destilado y el agua potable, empleando HNO₃-HCl y solamente HNO₃ durante el proceso de digestión. Obteniendo como resultado el incumplimiento del criterio de aceptación para exactitud según la recuperación de metal añadido para hierro y cobre, en las muestras de alcohol destilado digerido con HNO₃-HCl, pues como lo indica el Codex Comittee on Methods of Analysis and Sampling (2009) este debe ser de 90-110%.

En el caso del hierro y el zinc, tampoco se cumple con el criterio de aceptación para precisión, según lo establecido por ^{Clesceri, Greenberg y Eaton (1999}), debido a que la desviación estándar relativa supera el 10%. Además, se evidencia que en el caso del hierro y el zinc para las muestras de agua digeridas con HNO₃-HCl, se incumple en exactitud, y según los datos obtenidos para este último metal, también en precisión. No obstante, se observa una mejoría en las muestras de alcohol al realizar el proceso de digestión empleando únicamente HNO₃, ya que los tres metales implicados se encuentran dentro del criterio establecido tanto para exactitud, como para precisión. Con respecto a las muestras de agua digeridas solamente con HNO₃, de igual manera presentan un comportamiento más estable, sin embargo, en el caso del hierro no se cumple con el criterio de aceptación para precisión.

El ^{Laboratorio Nacional de Referencia para Metales Pesados en Alimentos y Piensos (2012),} para las bebidas alcohólicas de alta graduación con bajo contenido de azúcares (<50g/L), resulta necesario evaporar el alcohol mediante calentamiento hasta casi sequedad, para eliminar interferencias de este tipo. Asimismo, como lo refiere ^{Constanza y Restrepo (2011}), la materia orgánica presente en muestras de bebidas alcohólicas se elimina fácilmente por digestión.

Con respecto al medio ácido a utilizar en el proceso de digestión de las muestras de alcohol, resultó mejor el ácido nítrico, pues como lo respaldan ^{Clesceri et al (1999}), se utiliza el procedimiento de digestión menos riguroso requerido, para proporcionar una recuperación aceptable y consistente, compatible con el método analítico y el metal que se analiza. La digestión con HNO₃ arrojó una mejor recuperación para el cobre, el hierro y el zinc, además de menor variabilidad en los resultados.

Aunque algunas muestras requieren la adición de otros ácidos como perclórico o sulfúrico para completar la digestión, estos también pueden generar interferencias durante el análisis de algunos metales. Lo anterior se debe a que la matriz se transforma en una de mayor complejidad, lo cual podría ser una causa de los confusos resultados generados en el caso de la digestión al emplear HNO₃- HCl, de igual forma, dicha combinación de ácidos se recomienda para analizar metales como: plata, antimonio, rutenio y estaño, es decir, ninguno de los metales implicados. (^{Clesceri et al, 1999}).

También, se probó la determinación de los metales en las muestras de alcohol y agua sin digerir (Cuadro 3), y aunque en el alcohol se cumplen con los criterios de precisión, se demuestran porcentajes de recuperación menores al 80%; contrario a lo que sucede en el caso del agua, que los resultados fueron más precisos, y la recuperación dentro de lo deseable (90-110%). ^{Clesceri et al (1999}), afirman que muestras incoloras y transparentes (agua potable de primer nivel) con una turbidez <1 NTU, sin olor y de una sola fase, pueden ser analizadas directamente mediante espectroscopía de absorción atómica para metales totales sin digestión. No obstante, dichos autores enfatizan en la necesidad de realizar una verificación adicional donde se contrasten muestras digeridas y no digeridas para asegurar resultados comparables.

Linealidad del método analítico: Con respecto a la validación del parámetro de linealidad del método, en el cuadro 4 se determinó que el análisis de cobre cumple con el test de linealidad para el coeficiente de correlación, debido a que en la prueba t-student aplicada el t exp ˃ t tab, lo cual indica que se rechaza la hipótesis nula Ho, es decir, la correlación lineal es estadísticamente significativa con la probabilidad calculada. Asimismo, en el caso de la pendiente se observa que el t exp ˃ t tab, la pendiente difiere significativamente de cero, al igual que en el test del intercepto. En cuanto a este último criterio, si bien es cierto, lo ideal es que el intercepto difiera del cero lo menos posible, es decisión del laboratorio aceptar o rechazar la linealidad al verse afectada por este parámetro, ya que el mismo no es determinante en el análisis, en caso de que los demás parámetros hayan sido aceptados.

En la Figura 2, se estima que existe aleatoriedad en el análisis de los residuos, como lo refiere ^{Magnusson y Örnemark (2014}), la distribución aleatoria de residuales en torno a cero confirma la linealidad, mientras que las tendencias sistemáticas indican la no linealidad o un cambio de varianza con el nivel. Por último, cabe destacar que el coeficiente de variación de los factores de respuesta es inferior a 10%, tal como lo indica el ^{Codex Comittee on Methods of Analysis and Sampling (2009)}, por lo tanto, en términos generales, es posible afirmar que en el análisis de cobre se cumple con el criterio de linealidad.

Figura 2 Análisis de Residuales para la curva de calibración de cobre. 

Los resultados descritos en el cuadro 4, demuestran que el análisis de hierro cumple con el test de linealidad para el coeficiente de correlación, debido a que el t exp ˃ t tab, lo cual indica que se rechaza la hipótesis nula Ho. La correlación lineal es estadísticamente significativa con la probabilidad calculada. Asimismo, en el caso de la pendiente se observa que el t exp ˃ t tab, la pendiente difiere significativamente de cero, contrario a lo que sucede en el test del intercepto, pues t exp < t tab, es decir, el intercepto no difiere significativamente de cero, por tal motivo, también cumple con dicho criterio.

En la Figura 3, se observa que existe aleatoriedad en el análisis de los residuos, lo cual confirma que existe linealidad. Además, cabe destacar que el coeficiente de variación de los factores de respuesta es inferior a 10%, por lo tanto, es posible afirmar que en el análisis de Hierro se cumple con el criterio de Linealidad.

Figura 3 Análisis de Residuales para la curva de calibración de hierro. 

Igualmente, los expuesto en el cuadro 4 evidencia que el análisis de zinc cumple con el test de linealidad para el coeficiente de correlación, debido a que el t exp ˃ t tab, lo cual indica que se rechaza la hipótesis nula. En el caso de la pendiente se observa que el t exp ˃ t tab, la pendiente difiere significativamente de cero, al igual que en el test del intercepto. Sin embargo, como se mencionó en el caso del cobre, debido a que los demás parámetros cumplen con los criterios de aceptación, es decisión del laboratorio si se acepta o rechaza la linealidad al verse afectada por este parámetro, ya que el mismo no es determinante en el análisis. En la Figura 4 se demuestra que existe aleatoriedad en el análisis de los residuos, por lo que se justifica la linealidad del modelo. Con respecto al coeficiente de variación de los factores de respuesta, este es inferior a 10%. Por tal razón, el análisis de zinc cumple con el criterio de linealidad.

Figura4. Análisis de residuales para la curva de calibración de zinc. 

Precisión y exactitud del método: Para determinar la precisión del método, se evaluó la repetibilidad de las mediciones en el análisis de cobre, hierro y zinc (Cuadros 5, 6 y 7), a partir de seis muestras fortificadas con 1mg/L de cada metal. El coeficiente de variación para cada análisis de agua y alcohol es inferior al coeficiente de variación porcentual de Horwitz, ya que para la concentración de 1mg/L, dicho coeficiente no debe superar el 8%, lo cual indica que se cumple con el criterio establecido para repetibilidad a esa concentración.

En cuanto a la determinación del sesgo (exactitud) en las muestras de agua para el cobre (Cuadro 5), se arroja un t calc ˃ t crit, lo que indica que en el caso de estas muestras si existen diferencias significativas. Pero, utilizando el criterio relativo del valor obtenido con respecto al valor real, este es menor al 10%, por lo cual, siempre se considera aceptable el sesgo para el método, sin que esto genere alteración para los fines previstos de la metodología.

Por su parte, tanto para el hierro (Cuadro 6), como para el zinc (Cuadro 7), en ambas matrices estudiadas el t calc < t crit, lo cual significa que el sesgo obtenido y su veracidad es aceptable.

En la evaluación de la capacidad de recuperación del método se evidencia el cumplimiento de dicho criterio para ambos tipos de muestras en los tres metales, lo que genera confianza en los resultados de exactitud. El porcentaje de recuperación de cada metal se encuentra entre el 90-110%, por lo que, cumplen con el criterio de aceptación establecido por el Codex Comittee on Methods of Analysis and Sampling (2009).