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Introducción
El término “metal pesado” suele referirse a elementos químicos, en su mayoría metálicos, cuya densidad es superior a 5 kg dm-3 y su número atómico está por encima de 20. Debido a las pequeñas cantidades que se manejan, se denominan “elementos traza” o “metales traza” y se incluye el aluminio que no se puede calificar como “metal pesado” por las características antes mencionadas, pero sí por su toxicidad (Kozłowski et al., 2011).
Desde el punto de vista de los seres vivos, hay metales pesados que son nutrientes esenciales (Fe, Mn, Zn, Cu y Mo), otros son elementos beneficiosos en ciertas circunstancias (Ni, Cr, V, Ti, etc.) y elementos que, hasta el momento, no se considera que tengan funciones en los seres vivos (Cd, Hg, Pb, etc.), por lo que se consideran tóxicos. Tanto los elementos metálicos esenciales como los benéficos pueden provocar toxicidad si se sobrepasa el límite de tolerancia de cada organismo (Iram et al., 2013).
La contaminación por metales pesados es un problema que ha ido en aumento, debido a las actividades antrópicas. Entre las principales fuentes de contaminación se encuentran la minería, la metalúrgica, la agricultura, los vehículos automotores y el aporte natural en ciertos acuíferos (Suárez González et al., 2021).
La fitorremediación se define como el uso de plantas para eliminar, destruir o transformar contaminantes del suelo, agua y aire (Delgadillo-López et al., 2011). En este proceso, las plantas son seleccionadas por su potencial fisiológico, por presencia de enzimas presentes para tolerar y asimilar sustancias tóxicas, por su tasa de crecimiento, por la profundidad de sus raíces y su habilidad para bioacumular y/o degradar contaminantes (Silva et al., 2018), lo que indica que las plantas juegan un rol fundamental en los procesos de fitorremediación.
La tolerancia a elementos con potencial tóxico como metales esenciales y no esenciales, en los organismos vegetales, puede definirse como el resultado de un proceso evolutivo que confiere a distintas especies de plantas la capacidad de crecer y desarrollarse en ambientes con concentraciones elevadas de elementos con un potencial de toxicidad (Hu et al., 2018; Ramírez Gottfried et al., 2019). Los cambios evolutivos que han dado origen a la tolerancia se deben al desarrollo de una serie de mecanismos eficientes y específicos, mediante procesos adaptativos, que permiten mantener la toma de elementos esenciales dentro de intervalos fisiológicos permisibles, además de proporcionar la capacidad de inactivar a nivel metabólico los elementos esenciales y no esenciales cuando representan un riesgo para la integridad celular (Perales Aguilar et al., 2020).
Se han utilizado reguladores del crecimiento vegetal para incrementar la velocidad de crecimiento y la producción de biomasa en plantas hiperacumuladoras (Navarro-Aviñó et al. 2007) y agentes quelantes (Pabón et al., 2020), como uno de los mecanismos de tolerancia más importante utilizado por las plantas para reducir la toxicidad por metales pesados. El Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas de Cuba (INCA), obtuvo una mezcla de oligogalacturónidos (Ogal), que presenta una alta proporción de grupos funcionales ionizables, con un grado de polimerización (GP) entre 6 y 16, compuesta por cadenas lineales de ácido galacturónico (Mederos-Torres et al., 2011), que pudieran permitir la formación de complejos con los metales pesados. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de la aplicación de una mezcla de oligogalacturónidos sobre la actividad peroxidasa y los contenidos de malondialdehido, proteínas totales y clorofilas, en plantas de tomate var. Amalia sometidas a altos niveles de metales pesados.
Materiales y métodos
La presente investigación se realizó por un periodo de dos años (2019-2020), en el departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, perteneciente al Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), ubicado en el municipio de San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba.
Se colectó suelo clasificado como Ferralítico rojo amarillento lixiviado típico eútrico (Hernández-Jiménez et al., 2019), en áreas donde se descargan los residuos de la Empresa cerámica blanca Adalberto Vidal de San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, con altos contenidos de Cu, Cd y el Fe según Falcón Rodríguez et al. (2021). Se utilizó un suelo del mismo tipo sin contaminar, recolectado en el mismo sitio alejado de la fuente contaminante, como control absoluto. Los principales parámetros químicos y físico-químico del suelo contaminado y sin contaminar se indican en el Cuadro 1.
Cuadro 1 Características químicas y físico-químicas del suelo estudiado. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. 2021.
| Indicadores | Suelo no contaminado | Suelo contaminado | ||
|---|---|---|---|---|
| MO (%) | 3, 07± 0,02 | 2, 03± 0,03 | ||
| P(ppm) | 158,4±2,2 | 243,8±,2 | ||
| K | cmol kg-1 | 0,09±0,01 | 5,78±0,01 | |
| Ca | 29,33±0,16 | 35,63±0,12 | ||
| Mg | 6,5±0,2 | 9,8±0,3 | ||
| Cu | mg kg-1 | 159,9±1,8 | 786,3±2,3 | |
| Cd | 5,5±1,3 | 239,3±3,7 | ||
| Fe | 851,2±2,9 | 3 700,6±6,1 | ||
| pH (H2O) | 7,2 | 5,3 | ||
MO: materia orgánica. / MO: organic matter
El experimento se desarrolló mediante el uso de bolsas de 7 kg de capacidad, una mezcla de oligogalacturónidos (Ogal) y se utilizaron como modelo plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) de la variedad Amalia, cuyas semillas fueron suministradas por el Departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal del INCA, los tratamientos realizados se describen en el Cuadro 2.
Cuadro 2 Descripción de los tratamientos aplicados en un suelo contaminado, con las formas de aplicación independientes y algunas de sus combinaciones en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), San José de las Lajas, Cuba, 2021.
| Tratamiento | Descripción de los tratamientos | ||
| Suelo | Medio imbibición de semillas | Concentración y método de aplicación de Ogal | |
| 1 | Normal | Agua | - |
| 2 | Contaminado* | Agua | - |
| 3 | Contaminado | Ogal | - |
| 4 | Contaminado | Agua | Aplicado al suelo (30 mg kg-1) |
| 5 | Contaminado | Agua | Aspersión foliar (20 mg L-1) |
| 6 | Contaminado | Ogal | Aspersión foliar (20 mg L-1) |
| 7 | Contaminado | Agua | Aplicado al suelo y aspersión foliar |
* Suelo clasificado como ferralítico rojo amarillento lixiviado típico eútrico, contaminado con Cu, Cd y Fe. / *Soil classified as typical eutric leached red-yellow ferralitic, contamined with Cu, Cd, and Fe.
** Ogal: producto a base de oligogalacturónidos. / **Ogal: A product based on oligogalacturonides.
En todos los experimentos se utilizaron diez macetas por cada tratamiento, se sembraron tres semillas por maceta y a los siete días de emergidas las plantas se dejó solo una en cada maceta, con un diseño completamente aleatorizado. El riego se realizó mediante la aplicación de 50 mL de agua cada dos días. Este experimento se repitió tres veces en el tiempo (n= 70), los resultados que se presentan son los promedios de sus repeticiones.
Toma de muestras
Las muestras se obtuvieron a los 35 y 56 días de emergidas las plantas, se determinó el contenido de malondialdehido, la actividad peroxidasa, el contenido de proteínas totales y el contenido de clorofilas. Para la determinación de malondialdehido (MDA), la actividad de la enzima peroxidasa y las proteínas totales, se tomaron tres muestras cada una de 0,25 g por planta, estas se congelaron en el momento del muestreo al introducirlas en nitrógeno líquido y se conservaron a -60 ºC. Además, se tomaron tres discos en cada tratamiento para expresar los resultados de las determinaciones en base a la masa seca.
Para la extracción, las muestras se maceraron en nitrógeno líquido y se añadió 2,5 mL de tampón fosfato de sodio100 mmol L-1, pH 7,8, EDTA 0,1 mmol L-1, TritonX-100 0,1 % (v:v) y PVPP 1,5 % (m:v). luego se centrifugaron a 13 000 g durante 20 min a 4 ºC en una centrífuga refrigerada y se colectó el sobrenadante (extracto) para los análisis posteriores.
Determinación del contenido de malondialdehido
Para la determinación del contenido de malondialdehido se adicionó en tubos Eppendorf 0,5 mL de extracto, 0,5 mL de ácido tiobarbitúrico al 0,5 % (m:v) disuelto en ácido tricloroacético al 20 %. Se calentó la mezcla en baño de agua durante 25 min a 95 ºC y se detuvo la reacción al introducir los tubos en hielo. Luego, se centrifugó a 1300 g por 10 min. Se extrajo la fase sobrenadante y se realizó la lectura de absorbancia a 532 y 600 nm en un espectrofotómetro UV/ Visible. Se estimó la cantidad de MDA a partir del coeficiente de extinción de 155 mmol L-1 cm-1, expresándose como nmol de malondialdehido por milígramo de proteínas del sobrenadante.
Determinación de la actividad peroxidasa
Para la determinacion de la actividad de la peroxidasa se añadió 50 µL de extracto y se le adicionó una mezcla de reacción que contenía 100 mmol L-1 del tampón fosfato, pH 7, pirogalol 40 mmol L-1 y peróxido de hidrógeno 0,25 % (v:v), en un volumen total de 1 mL. La formación de pirogalol oxidado se midió en un espectrofotómetro UV/Visible, a través del monitoreo del incremento de la absorbancia de la purpurogalina a 420 nm cada 10 s en un intervalo de 1 min. La actividad enzimática se expresó como µmol de producto transformado por minuto por mg de proteína (actividad específica).
Cuantificación de proteínas totales
Las proteínas totales se cuantificaron por el método de Micro-Lowry, para lo cual se tomaron 20 µL de extracto en tubos Eppendorf y se le añadió 180 µL de H2O y 1 mL de reactivo de Lowry, se agitó en un vórtex durante 10 s y se dejó reposar 10 min a temperatura ambiente, luego se añadió 100 µL del reactivo de Folin-Ciocalteau, se agitó y se dejó reposar 30 min a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se realizó la lectura a 750 nm en un espectrofotómetro UV/Visible. Se utilizó la albúmina de suero bovino (BSA) para realizar la curva patrón.
Determinación del contenido de clorofilas
La determinación del contenido de clorofilas se estimó a través de un medidor portátil de clorofilas MINOLTA SPAD* 502 plus (Soil Plant Analysis Development), las mediciones se realizaron en la tercera hoja bien desarrollada del ápice hacia abajo. Los datos se expresaron en unidades SPAD.
Análisis de datos
Para el análisis de los datos se verificó la distribución normal a través de la prueba de Kolmogorov- Smirnov y la homogeneidad de varianza de los datos. Los resultados se sometieron a análisis de varianza (ANDEVA) de clasificación simple y doble (en función de los objetivos del experimento), en caso de diferencias significativas, las medias se compararon según la prueba de Tuckey (p≤0,05). Para el procesamiento de los datos se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus versión 5.0 para Windows.
Resultados
Los resultados de la determinación de los indicadores bioquímico-fisiológicos evidenciaron las afectaciones en la síntesis de proteínas por la contaminación, la cual fue significativamente (p<0,05) atenuada por todas las variantes de uso de la mezcla Ogal (Cuadro 3). Las alternativas de aplicación que provocaron niveles equivalentes o muy semejantes al detectado en las plantas crecidas en condiciones normales fueron las independientes. Para el caso del contenido de proteínas, la inclusión de la mezcla Ogal en todas las formas de aplicación, atenuó la disminución que provoca el estrés metálico en ambos momentos. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas respecto a plantas no contaminadas. Una tendencia equivalente se registró en cuanto a la actividad enzimática de las peroxidasas, aunque en general, los valores estuvieron por encima de los encontrados en las plantas de las condiciones normales (Cuadro 3).
Cuadro 3 Contenido de malondialdehido (mmol g-1 MS), actividad enzimática peroxidasa (µmol min-1 g-1 MS) y concentracón de proteínas (mg g-1 MS), en las hojas de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) con diferentes formas de aplicación de la mezcla de Ogal en suelos contaminado y sin contaminar a los 35 y 48 días de germinadas las plantas en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), San José de las Lajas, Cuba. 2021.
| Proteína foliar (mg g-1 MS) | Actividad enzimática peroxidasa (µmol min-1 g-1 MS) | Malondialdehido (mmol g-1 MS) | ||||
| Días | 35 | 48 | 35 | 48 | 35 | 48 |
| T1 | 5,6a | 5,5a | 1,1730d | 1,3612e | 0,4410d | 0,4523g |
| T2 | 3,2c | 3,1c | 1,9021a | 1,9472a | 0,8446a | 0,8241a |
| T3 | 3,6bc | 3,7bc | 1,5932b | 1,6874bc | 0,6432b | 0,6548d |
| T4 | 4,3b | 4,5ab | 1,7947a | 1,7803b | 0,6925b | 0,7123b |
| T5 | 3,9bc | 4,0bc | 1,6556b | 1,6596bc | 0,6544b | 0,6695c |
| T6 | 3,4c | 3,6bc | 1,2837d | 1,4578de | 0,5203c | 0,5364f |
| T7 | 3,5c | 3,8bc | 1,4267c | 1,5640cd | 0,5397c | 0,5512e |
| ESx | 0,23** | 0,40* | 0,04*** | 0,04*** | 0,03*** | 0,07*** |
T1- Suelo normal y semillas embebidas en agua (Control), T2- Suelo contaminado y semillas embebidas en agua, T3- Suelo contaminado y semillas embebidas con Ogal (30 mg L-1), T4- Suelo contaminado y aplicación de Ogal al suelo (30 mg kg-1) y semillas embebidas con agua, T5- Suelo contaminado, semillas embebidas en agua y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1), T6- Suelo contaminado, semillas embebidas con Ogal (30 mg L-1) y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1), T7- Suelo contaminado y aplicación de Ogal al suelo (30 mg kg-1) y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1). ESx: error estandar. *Letras diferentes indican diferencias significativas (p≤0.05) según la pruebaTukey. / T1- Normal soil and seeds soaked in water (Control), T2- Contaminated soil and seeds soaked in water, T3- Contaminated soil and seeds soaked with Ogal (30 mg L-1), T4- Contaminated soil and Ogal application to the soil (30 mg kg-1) with seeds soaked in water, T5- Contaminated soil, seeds soaked in water, and foliar spray with Ogal (20 mg L-1), T6- Contaminated soil, seeds soaked in Ogal (30 mg L-1), and foliar spray with Ogal (20 mg L-1), T7- Contaminated soil treated with Ogal application to the soil (30 mg kg-1) with foliar spray of Ogal (20 mg L-1). ESx: Standard error. *Different letters indicate significant differences (p≤0.05) according to the Tukey’s test.
En cuanto a los niveles de malondialdehido, se evidenció que tanto a los 35 como a los 48 días, la inclusión de la mezcla de Ogal provocó que disminuyeran significativamente, en comparación con el de las plantas crecidas en el medio contaminado sin su aplicación, se obtuvieron en algunos casos valores semejantes al de las plantas en condiciones normales, para los tratamientos combinados.
Tanto a los 35 como a los 48 días, el contenido en pigmentos fotosintéticos (Cuadro 4) se vio reducido en las plantas cultivadas en suelo contaminado sin el uso de Ogal (T2), en comparación con el tratamiento control (T1). En las plantas donde se usaron las diferentes formas de aplicación del Ogal, no se observaron diferencias significativas, donde los tratamientos en los que se aplicaron de forma combinada fueron los que mostraron las menores afectaciones.
Cuadro 4 Unidades SPAD en las hojas de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) con diferentes formas de aplicación de la mezcla de Ogal en suelos contaminado y sin contaminar a los 35 y 48 días de germinadas las plantas en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), San José de las Lajas, Cuba. 2021.
| Días | Tratamiento | ESx | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | ||
| 35 | 30,12a | 14,6e | 21,76cd | 20,42d | 22,94c | 27,52b | 26,32b | 0,58*** |
| 48 | 45,44a | 20,46e | 22,92d | 23,82d | 22,48d | 33,12b | 29,46c | 0,62** |
T1- Suelo normal y semillas embebidas en agua (Control), T2- Suelo contaminado y semillas embebidas en agua, T3- Suelo contaminado y semillas embebidas con Ogal (30 mg L-1), T4- Suelo contaminado y aplicación de Ogal al suelo (30 mg kg-1) y semillas embebidas con agua, T5- Suelo contaminado, semillas embebidas en agua y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1), T6- Suelo contaminado, semillas embebidas con Ogal (30 mg L-1) y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1), T7- Suelo contaminado y aplicación de Ogal al suelo (30 mg kg-1) y aspersión foliar con Ogal (20 mg L-1). ESx: error estandar. *Letras diferentes indican diferencias significativas (p≤0.05) según la pruebaTukey. / T1- Normal soil and seeds soaked in water (Control), T2- Contaminated soil with seeds soaked in water, T3- Contaminated soil and seeds soaked in with Ogal solution (30 mg L-1), T4- Contaminated soil with Ogal (30 mg kg-1) with seeds soaked with water, T5- Contaminated soil, seeds soaked in water, and foliar spray with Ogal (20 mg L-1), T6- Contaminated soil with seeds soaked in Ogal (30 mg L-1), and foliar spray with Ogal (20 mg L-1), T7- Contaminated soil treated with Ogal (30 mg kg-1) and foliar spray of Ogal (20 mg L-1). ESx: Standard error. *Different letters indicate significant differences (p≤0.05) according to the Tukey’s test.
Discusión
Las modificaciones encontradas en el contenido de proteínas, la actividad enzimática peroxidasa y el contenido de malondialdehido MDA en las plantas de tomate, son un indicador del daño oxidativo provocado por la acumulación de metales pesados en los tejidos de la planta. El efecto que los altos niveles de metales pesados producen en las plantas, se vieron atenuados producto de la aplicación de la mezcla de Ogal, lo que indica el efecto beneficioso de la asociación de la mezcla de Ogal con metales pesados. La producción de especies reactivas de oxígeno y el daño oxidativo se redujo, lo cual trae consigo una mayor detoxificación en las plantas. Esta disminución en el contenido de proteína foliar guarda estrecha relación con los mecanismos de adaptación de las plantas al estres metálico, por tanto, se ve modificado el metabolismo del nitrógeno (Beltrán-Pineda & Gómez-Rodríguez, 2016).
La presencia de los metales pesados en el medio pudo activar mecanismos de defensa de la planta, relacionados con la producción de enzimas con actividad peroxidasa, como por ejemplo la ascorbato peroxidada, que están implicadas en varios procesos fisiológicos como la desintoxicación del peróxido de hidrógeno, el catabolismo de las auxinas, la lignificación, la suberización, la respuesta a estrés y la senescencia (Delgado-Oramas, 2020).
Las plantas crecidas en el medio contaminado sin la aplicación de Ogal mostraron valores superiores a las plantas control y a todas en las que se emplearon diferentes formas de aplicación de este producto. En estas plantas la actividad de esta enzima manifestó valores intermedios entre T1 y T2. La combinación de la aplicación de Ogal al suelo y la aspersión foliar indujeron valores más cercanos a los de las plantas no estresadas por los metales pesados.
La concentración de malondialdehido es un indicador del estrés oxidativo, en la presente investigación se pudo observar un aumento de los valores de malondialdehido en las plantas sometidas a altos niveles de cationes metálicos con respecto al control, lo que sugiere el efecto en estrés oxidativo del catión metálico, que aumenta la actividad de enzimas lipoxigenasas, que catalizan la peroxidación de lípidos. Además, numerosos estudios informan que los niveles de malondialdehido se incrementan en plantas expuestas a tratamientos con cationes metálicos (Pérez-Álvarez et al., 2022; Sánchez-Zepeda et al., 2021). Se observó de forma preliminar, que los incrementos que el estrés produce en los niveles de malondialdehido y la actividad enzimática peroxidasa, se ven reducidos con la aplicación de reguladores del crecimiento (Alcántara Cortes et al., 2019; Vieira de Sousa et al., 2021).
El contenido de malondialdehido fue superior en las plantas que crecieron en el medio contaminado sin la aplicación de la mezcla Ogal. Las alternativas de combinación de las formas de uso de la mezcla de Ogal fueron con las que se registraron los valores más próximos al de las plantas en condiciones normales, lo que refleja el efecto de los reguladores del crecimiento en la disminución del estrés oxidativo. La disminución de pigmentos fotosintéticos ya ha sido descrita en muchas especies (Llatance Oyarce et al., 2019; Hernández-Baranda et al., 2019; Perales Aguilar et al., 2021) como consecuencia de la exposición a metales pesados.
Se comprobó una sensible reducción de pigmentos fotosintéticos en aquellas plantas crecidas en el suelo contaminado por los cationes metálicos. La disminución más drástica se registró en las plantas en las que no se empleó ninguna de las formas de aplicación de la mezcla Ogal. La combinación de la imbibición de las semillas y la aspersión foliar provocó un descenso menos pronunciado del contenido de estos pigmentos. La clorosis es uno de los primeros síntomas de fitotoxicidad por metales pesados que muestran las plantas y además, se ha visto que esta reducción es mayor en el caso de las hojas en desarrollo que en las hojas completamente desarrolladas (Apaza Machaca et al., 2019).
Los sistemas enzimáticos relacionados con el metabolismo de la clorofila pueden afectarse durante el estrés abiótico por la presencia de metales, por lo que la respuesta encontrada para este indicador puede ser el resultado de la inhibición de las enzimas de su ruta biosintética o por la modificación de la absorción de nutrientes esenciales (Romero-Puertas et al., 2019; Terrón-Camero et al., 2020). Lo obtenido en cuanto a este indicador está en correspondencia con los resultados encontrados por Delince et al. (2015), quienes evaluaron el comportamiento de algunos indicadores bioquímicos-fisiológicos, en condiciones semicontroladas, en los cultivos de papa (Solanum tuberosum L.) y arroz (Oryza sativa L.) sometidos a condiciones de estrés metálico, similar a lo obtenido al determinar la respuesta a diversos estreses medioambientales de plantas cultivadas con estimuladores del crecimiento (Espinosa-Antón et al., 2020; Hong Zhang et al., 2014).
Los resultados indican que las concentraciones de metales pesados presentes en el suelo, aún cuando sobrepasaron los límites permisibles generales, no resultaron ser letales para las plantas, ya que no se evidenciaron efectos fitotóxicos visibles, por lo que se puede expresar que las mismas han desarrollado mecanismos de adaptación ante las altas concentraciones metálicas, que le permiten subsistir en estas condiciones de estrés abiótico, como plantean Guzmán-Morales et al. (2019). Esto último es de gran interés científico-técnico, pues no hay información anterior de aplicaciones de la mezcla de Ogal en esta etapa de crecimiento del cultivo del tomate en un suelo contaminado. Se hace necesario, por tanto, continuar la investigación, dado que la respuesta de las plantas de tomate dependerá en gran medida de las condiciones de crecimiento.
Conclusiones
Los resultados obtenidos, según los indicadores bioquímicos evaluados, contenido de malondialdehido, actividad peroxidasa, contenido de proteínas totales y contenido de clorofilas, indican que la mezcla de Ogal atenuó el efecto fitotóxico que provocan las altas concentraciones de Cu, Cd y Fe a plántulas de tomate hasta la fase de floración, por lo que la mezcla de Ogal muestra potencialidades para ser utilizada en la fitorremediación de medios contaminados. En la actualidad, está siendo objeto de estudio, para la introducción y validación, lo que posibilita un acercamiento a la rentabilidad de los suelos con altos niveles de cationes metálicos y el incremento de la biodiversidad de especies en ecosistemas frágiles y degradados.
