Revisión Bibliográfica

Técnicas de conservación in vitro para el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales¹

Neiva Sánchez-Chiang², Víctor M. Jiménez³

2 Centro de Investigaciones en Protección de Cultivos (CIPROC), Universidad de Costa Rica, 2060 San Pedro, Costa Rica. neiva.sanchez@ucr.ac.cr

3 Centro para Investigaciones en Granos y Semillas (CIGRAS), Universidad de Costa Rica, 2060 San Pedro, Costa Rica. victor.jimenez@ucr.ac.cr

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Resumen

Técnicas de conservación in vitro para el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales. El objetivo de esta revisión bibliográfica fue describir las principales técnicas para conservación in vitro de germoplasma por corto y largo plazo. Estas técnicas permiten el establecimiento de bancos de germoplasma. Este trabajo se centra en su uso en cultivos tropicales. Las técnicas de conservación in vitro han permitido la preservación de recursos fitogenéticos para su uso ulterior con fines de mejoramiento genético, investigación y de seguridad alimentaria. En muchos centros de investigación se han utilizado estas técnicas para almacenar tejidos y semillas de cultivos tropicales, los cuales de forma convencional son difíciles de preservar.

Palabras clave: Crioconservación, cultivo de tejidos, recursos fitogenéticos.

Abstract

Techniques for in vitro conservation and their use for establishing germplasm banks of tropical crops. The aim of this literature review is to describe the main techniques for short and long term germplasm conservation. These techniques allow establishment of germplasm banks. This article focuses on their use in tropical crops. In vitro preservation techniques have allowed conservation of plant genetic resources for further use in plant breeding, research and food security purposes. Several research centers have used these techniques for tissue and seed storage of tropical crops, mainly for those that are difficult to preserve conventionally.

Key words: Cryopreservation, tissue culture, phytogenetic resources.

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Introducción

Los recursos fitogenéticos son la base de la seguridad alimentaria mundial. Por ello es de suma importancia mantener la diversidad genética de las variedades tradicionales y regionales, de los cultivares mejorados y de plantas silvestres (Rao 2004). La diversidad genética provee a los agricultores y mejoradores genéticos con opciones para desarrollar nuevos cultivares o híbridos, los cuales pueden ser más productivos, tener mejores características de fruto, flor o estructura de planta, resistencia o tolerancia a patógenos y/o tolerancia a condiciones ambientales desfavorables (Rao 2004, Keller et al. 2006).

Anualmente se pierden más de 15 millones de hectáreas de bosque tropical por deforestación causada por diversas actividades de desarrollo, como proyectos hidroeléctricos, caminos, urbanizaciones y ciertas prácticas agrícolas (como extensas áreas de monocultivos) (Rao 2004). En estos bosques se pueden encontrar la diversidad genética necesaria para el mejoramiento genético de muchos cultivos tropicales. El papel de los bancos de germoplasma para reducir esta pérdida y poder conservar muchas especies silvestres, cultivares locales tradicionales, así como variedades mejoradas, puede ser fundamental (Rao 2004, Wang et al. 2005). El concepto de conservación de los recursos fitogenéticos en bancos de germoplasma incluye la utilización de métodos que capten la máxima diversidad de genotipos, así como el uso de técnicas de conservación y posterior regeneración que mitiguen sus pérdidas a través del tiempo (Rao 2004).

La conservación de germoplasma de cultivos tropicales se ha tratado de realizar ex situ e in situ (Rao 2004). La vía ex situ se realiza en repositorios especiales (en sitios fuera del centro de origen de la especie) que proveen las condiciones adecuadas para la conservación de material propagativo por largo tiempo (Withers et al. 1990). Los métodos de conservación ex situ incluyen el almacenamiento de semillas, bancos de genes en campo, colecciones in vitro y jardines botánicos (Withers et al. 1990, Rao 2004, Quirós et al. 2008, Soengas et al. 2009).

El método más utilizado en la vía ex situ son los bancos de semillas. Estos presentan la ventaja de que se pueden almacenar muchos genotipos en espacios reducidos y es apto para la conservación de especies con semillas ortodoxas (semillas que pueden deshidratarse y almacenarse entre 0 y -20 °C por largo tiempo) (Withers et al. 1990, Soengas et al. 2009). Sin embargo, este método es poco adecuado para la conservación de especies con semillas recalcitrantes (semillas que no soportan la deshidratación, por lo que deben ser almacenadas en ambientes húmedos y conservan su capacidad germinativa únicamente por corto tiempo). Esto es crítico porque muchos de los cultivos tropicales de importancia económica, como palma aceitera (Elaeis guineensis), cacao (Theobroma cacao), coco (Cocos nucifera), aguacate (Persea americana), mango (Mangifera indica) y café (Coffea spp.), poseen este tipo de semilla (Withers et al. 1990, Engelmann 1991, 2000). Otra desventaja del uso de semillas en programas de conservación por medio de bancos de germoplasma es la dificultad para obtener este tipo de estructuras en algunas especies que tienen un largo periodo juvenil, como el pérsimon (Dyospiros kaki) (Ma tsumoto et al. 2001). Por otro lado, existen plantas que se propagan principalmente de forma vegetativa, como yuca (Manihot spp.), papa (Solanum spp.), ñame (Colocasia esculenta), cebolla y ajo (Allium spp.), y banano y plátano (Musa spp.), en las cuales no es tan fácil la obtención de semillas sexuales (Withers et al. 1990, Engelmann 1991, Bessembinder et al. 1993, Sa nt et al. 2008).

Los bancos de genes en campo y los jardines botánicos presentan los inconvenientes de tener altos costos de mantenimiento, de necesitar de condiciones especiales para ciertas plantas que se encuentran fuera de su hábitat natural (por ejemplo, plantas tropicales que son llevadas a jardines botánicos en climas templados, donde es necesario proveerles de condiciones con alta humedad y regulación de la temperatura). Esto implica un riesgo por pérdida de materiales a causa de factores ambientales. Además, se requieren de grandes extensiones y gran cantidad de muestras representativas (20 a 30 plantas de una sola población) por lo que su uso se ha visto limitado en cierta medida (Withers et al. 1990, Engelmann 1991, Matsumoto et al. 2001, Popova et al. 2003, Wang et al. 2005).

La vía de conservación in situ involucra el mantenimiento de los recursos genéticos en el centro de origen (sitios donde se dio la especiación y generalmente se encuentra la mayor diversidad genética) o cultivo en campos de productores agrícolas en sistemas de agricultura tradicional (Rao 2004). Sus requerimientos, en cuanto a espacio y mantenimiento, son similares a los indicados para los bancos de genes en campo.

Para solucionar los inconvenientes de las vías mencionadas anteriormente se puede recurrir a la conservación de especies tropicales en condiciones in vitro. En esta revisión bibliográfica se presentan las técnicas para la conservación in vitro de germoplasma en el corto y el largo plazo, que permiten el establecimiento de bancos de germoplasma en cultivos tropicales y se hace un listado de ejemplos de estos últimos.

Bancos de germoplasma in vitro

Los bancos de germoplasma in vitro son sitios para la conservación de los recursos genéticos en condiciones controladas de laboratorio y que involucran diversas técnicas de cultivo y almacenamiento in vitro. En los mismos se busca maximizar la diversidad de ejemplares recolectados de poblaciones en campo o en su centro de origen. La unidad de colección que se mantiene en condiciones controladas puede ser la semilla botánica o explantes vegetativos, dependiendo principalmente del hábito de crecimiento de la especie (Rao 2004, Wang et al. 2005, Tyagi et al. 2007).

Para proveer a los explantes y semillas las condiciones adecuadas de almacenamiento in vitro se han desarrollado técnicas que permiten mantener una alta diversidad en espacios reducidos, en condiciones asépticas y a salvo de los riesgos ambientales que podrían provocar su pérdida (Withers et al. 1990; Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Tyagi et al. 2007). Por ejemplo, embriones y cotiledones de Arachis retusa fueron conservados in vitro para superar los problemas de baja viabilidad en el almacenamiento de la semilla sexual, debido al alto contenido lipídico (Gagliardi et al. 2007).

Además, con el cultivo in vitro se facilita el intercambio de material genético, ya que muestras pequeñas pueden ser enviadas en condiciones asépticas, incluso a países con regulaciones fitosanitarias muy estrictas (Withers et al. 1990, Engelmann 1991, Dixit et al. 2004).

Tipos de almacenamiento in vitro

El almacenamiento in vitro se puede clasificar, según su duración, en "almacenamiento por corto plazo" (conocido en inglés como "short-term storage") y en "almacenamiento por largo plazo" (conocido en inglés como "long-term storage"). En el primer tipo, generalmente se utilizan técnicas de cultivo in vitro que fomenten el crecimiento reducido, mientras que en el segundo se utiliza principalmente la crioconservación (Withers et al. 1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Keller et al. 2006, Cousins y Adelberg 2008).

Almacenamiento por corto plazo y principales factores involucrados

En el almacenamiento por corto plazo los explantes permanecen in vitro hasta por 12 meses, manejando condiciones de cultivo para retrasar el crecimiento y aumentar los intervalos entre subcultivos (Withers et al. 1990, Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005, Cousins y Adelberg 2008). Por ejemplo, Marin y Duran-Vila (1991) conservaron segmentos nodales juveniles enraizados de naranja dulce (Citrus sinensis), naranja trifoliada (Poncirus trifoliata), lima mexicana (C. aurantifolia), toronja (C. paradisi) y limón Eureka (C. limon) durante un año mediante esta técnica.

Como parte de las estrategias empleadas para disminuir el crecimiento de los explantes y aumentar los intervalos entre subcultivos, está el reducir la temperatura de los cuartos de crecimiento, modificar los medios de cultivo y otros factores ambientales que se deben tomar en cuenta para optimizar el almacenamiento (Withers et al. 1990, Engelmann 1991). A continuación se hará referencia a los principales factores que se deben tomar en consideración para el almacenamiento por corto plazo.

Temperatura

Se produce una reducción en la actividad metabólica y, en consecuencia , en el crecimiento de los explantes, al disminuir la temperatura de cultivo (esta temperatura depende de los requerimientos de cada especie ) (Engelmann 1991). Generalmente se utilizan temperaturas alrededor de los 4 °C para cultivos de clima templado y entre 10 y 15 °C para el germoplasma tropical (Keller et al. 2006). El control de la temperatura se combina usualmente con otros factores para lograr un crecimiento reducido. En banano, temperaturas reducidas se han combinado con reducción en la intensidad lumínica o la completa supresión de luz. La propagación vegetativa de los tallos de banano normalmente se realiza a 22 °C con una intensidad lumínica de 3000 lux. Si n embargo, para su almacenamiento por corto plazo, se colocan a 15 °C bajo una intensidad lumínica de 1000 lux (Banerjee y Sharma 1988).

Si se mantienen los explantes a temperaturas bajas (inferiores a 4 °C) por períodos prolongados, pueden presentarse daños fisiológicos, causados por el frío, que inciden en cambios en el metabolismo, en el contenido de proteínas, y en la composición y funcionamiento de las membranas (Engelmann 1991). Estos problemas pueden ser reversibles cuando no hay exposición prolongada a esta condición. Generalmente, las plantas tropicales son sensibles a daños por frío y la temperatura de almacenamiento depende de la sensibilidad particular de cada especie (Engelmann 1991). Por ejemplo, Gangopadhyay et al. (2005) determinaron  que la temperatura de almacenamiento óptima para microtallos encapsulados de piña (Ananas comosus L.) era de 8 oC para un periodo de 45 a 60 días.

En las especies no tropicales, la reducción de temperatura actúa, muchas veces, como señal para romper el estado de reposo de los explantes e inducir la activación de su crecimiento. Por ejemplo, el almacenamiento de lirio (Lilium longiflorum L.) a bajas temperaturas (0-10 °C) indujo la ruptura del estado de reposo que llevó, consecuentemente, a su germinación y floración. Por lo tanto, su almacenamiento in vitro debió ser realizado a 25 °C, en medio de cultivo con todas las sales minerales (a un cuarto de su concentración) y vitaminas del medio Murashige y Skoog (1962) (MS) y una concentración alta de sacarosa (9%) por 28 meses. Esta medida permitió mantener una viabilidad superior al 84% (Bonnier y Van Tuyl 1997). Además, en ese trabajo, el manejo de la temperatura se combinó con una reducción de los nutrientes disponibles en el medio de cultivo, aspecto que también es de gran importancia, como se discutirá a continuación. Ambas medidas permitieron retardar el proceso de crecimiento y prolongar el almacenamiento.

Medio de cultivo

La reducción en la concentración de elementos minerales y/o carbohidratos metabolizables (por ejemplo, sacarosa) en el medio de cultivo puede ser una estrategia importante para la reducción del crecimiento del explante (Engelmann 1991, Rao 2004). Otras medidas pueden ser el aumentar el potencial osmótico del medio (especialmente mediante el uso de carbohidratos no metabolizables, como el manitol), el uso de concentraciones mayores de gelificantes, la adición de ciertos reguladores de crecimiento (como el ácido abscísico [ABA]), o de otras sustancias (como el cloruro de magnesio) para reducir daños en el explante. Como consecuencia de las medidas anteriores, el explante absorbe los nutrientes más lentamente y ocurre una reducción en el crecimiento (Engelmann 1991). Por ejemplo, para disminuir un problema de necrosis en explantes de banano in vitro, se suplementó el medio de cultivo con 50-100 mg/l de cloruro de magnesio. Con esta medida se logró la recuperación del 90% de los explantes que se encontraban en estados iniciales de necrosis (Martin et al. 2007).

En el caso de Curcuma longa, una planta aromática tropical utilizada en la cocina del medio oriente y asiática, el uso de agar y altas concentraciones de sacarosa (10%) en el medio de cultivo permitió su almacenamiento durante 23 semanas (Tyagi et al. 2007).

Recipiente de cultivo

El volumen del recipiente de cultivo puede ser determinante para definir la frecuencia de subcultivos y el almacenamiento óptimo de los explantes (Engelmann 1991, Keller et al. 2006). Por ejemplo, en Curcuma longa se utilizaron envases con capacidad de 180 ml para el almacenamiento a corto plazo (durante seis semanas) y de 2,5 l para el almacenamiento más prolongado (durante 23 semanas). Esto permitió una optimización en el almacenamiento de esta especie al utilizar eficientemente al volumen del recipiente según las necesidades de crecimiento del explante (Cousins y Adelberg 2008).

Modificación del ambiente gaseoso

La reducción del crecimiento se puede lograr también al disminuir el nivel de oxígeno disponible para los explantes. Sin embargo, bajo esas condiciones de almacenamiento, a menudo se desarrollan tejidos hiperhídricos, necróticos y con crecimiento más lento (Engelmann 1991). La hiperhidricidad es un desorden fisiológico que se caracteriza por la apariencia vidriosa e hinchada en los tejidos, tallos turgentes, acuosos e hipolignificados y órganos translúcidos, verdes, quebradizos y con deformaciones en la cutícula y epidermis (Debergh et al. 1992, Chakrabarty et al. 2003, 2005). Cabe mencionar que la necrosis de explantes, a causa de la reducción de oxígeno, se ha logrado disminuir al adicionar nitrato de plata, giberelinas, fructuosa, calcio, ácido ascórbico y/o carbón activado al medio de cultivo (Engelmann 1991, Chakrabarty et al. 2005).

Un método para la modificación del ambiente gaseoso consiste en bajar la presión parcial del oxígeno usando atmósferas controladas o disminuyendo la presión atmosférica de la cámara. Esto ha permitido el almacenamiento in vitro de especies tropicales sensibles a bajas temperaturas (Engelmann 1991). Otro método para limitar el nivel de oxígeno disponible es el uso de una capa de aceite mineral o medio líquido para cubrir los explantes (Rao 2004).

Encapsulación

En la técnica de encapsulación se recubren embriones somáticos, yemas gametofíticas (en briófitas) o ápices, con una cubierta gelatinosa, como por ejemplo de alginato de calcio, para formar "semillas sintéticas". La protección que provee el encapsulamiento confiere, a la vez, resistencia contra la deshidratación y las bajas temperaturas durante el almacenamiento por corto plazo (Engelmann 1991, Mallón et al. 2007). Por ejemplo, ápices de fresa de la variedad comercial "Senga Sengana" y moras de la variedad comercial "Norma" permanecieron encapsulados durante nueve meses. El medio de encapsulación contenía alginato de calcio y el medio nutritivo con todas las sales minerales y vitaminas de MS. Cada ápice permaneció dentro de la estructura gelatinosa en forma de perla, almacenado en oscuridad a 4 °C (Lisek y Orlikowska 2004).Otros ejemplos fueron realizados con microtallos (2-5 mm) de piña encapsulados también con alginato de calcio y almacenados a 4 °C. Estos mantuvieron la viabilidad y la capacidad de brotación hasta por 45 días (Soneji et al. 2002). Embriones somáticos encapsulados de Citrus reticulata Blanco cv. Mandarino Tardivo di Ciaculli se mantuvieron viables por 60 días a 4 °C (Germanà et al. 2007). En el caso de la papaya (Carica papaya L.), Castillo et al. (1998) mencionaron el potencial que presenta la encapsulación de embriones somáticos para el almacenamiento de germoplasma, la producción y la propagación de clones, el fácil manejo, y la facilidad para implementar la automatización a gran escala.

Almacenamiento por largo plazo y principales factores involucrados

El almacenamiento por largo plazo es muy seguro por lo que se usa extensivamente en agricultura, horticultura, y forestería para la investigación y el monitoreo ambiental (Benson et al. 2006). Esta técnica permite almacenar semillas (Berjak et al. 2000, Dussert et al. 2000), semillas sintéticas (Paulet y Engelmann 1994), meristemas y ápices (Escobar et al. 2000, González-Arnao et al. 2000, Hirai y Sakai 2000, Panis et al. 2000b, Pennycooke y Towill 2000, Takagi 2000, Thinh et al. 2000), polen (Inagaki 2000, Ng y Daniel 2000, Towill y Walters 2000), células (Rei nhoud et al. 2000), callos y suspensiones celulares (Panis et al. 2000a). Además, requiere de poco espacio y mantenimiento (Paulet y Engelmann 1994, Matsumoto et al. 2001, Wang et al. 2005).

Se considera que el almacenamiento por largo plazo es una práctica útil para evitar la variación somaclonal en plantas con propagación vegetativa y permite mantener los explantes sin alteración alguna bajo estas condiciones, prácticamente por tiempo indefinido (Engelmann 1991). Papa (Zhao et al. 2005) y café (Kumar et al. 2006) son dos especies difíciles de almacenar por otros métodos. El café produce semillas recalcitrantes, las cuales pierden viabilidad con rapidez durante el almacenamiento convencional y los bancos de germoplasma ex situ presentan altos costos de mantenimiento. Es por esto que el almacenamiento por largo plazo es una alternativa adecuada. Los embriones de café pueden preservarse en nitrógeno líquido (NL) hasta por un año, sin que estos sufran pérdida de viabilidad o alteraciones por variación somaclonal (Kumar et al. 2006, Santana-Buzzy et al. 2007).

Para el almacenamiento por largo plazo, generalmente se utiliza la crioconservación, aunque existe también la posibilidad de utilizar otras técnicas de cultivo in vitro en condiciones de crecimiento reducido. La crioconservación permite el almacenamiento de células, tejidos u órganos vegetales vivos a temperaturas extremadamente bajas (-80 °C). Esta técnica permite el almacenamiento durante períodos prolongados (mayores a un año) utilizando NL, el cual normalmente se encuentra a -196 °C. En algunas ocasiones, se combina el NL con otros gases inertes (como el helio y el argón) (Wilkinson et al. 2003, Benson et al. 2006, GarcíaÁguila et al. 2007).

El nitrógeno líquido se utiliza porque detiene todas las actividades metabólicas, inmediatamente al hacer contacto con el explante (Withers et al. 1990, Engelmann 1991) y, a la vez, permite que los tejidos conserven la viabilidad sin que ocurran alteraciones fisiológicas (Benson et al. 2006).

El proceso de crioconservación se inicia con el acondicionamiento criogénico, que incluye el enfriamiento (como se describió anteriormente con el uso de temperaturas bajas durante el almacenamiento por corto plazo) y la aplicación de sustancias crioprotectantes, luego el almacenamiento a -80 °C y por último el proceso de recuperación (Pennycooke y Towill 2000).

El tratamiento con sustancias crioconservantes o crioprotectantes previene el daño por frío en los tejidos al desplazar el agua que se encuentra intra e intercelularmente. Esta remoción de agua evita la ruptura de las membranas en las células (Matsumoto et al. 2001, Wilkinson et al. 2003, Sant et al. 2008). Estas sustancias crioprotectantes contienen concentraciones altas de sacarosa (0,4 M), glicerol (15%), dimetil sulfóxido (DMSO ) (15%), etilenglicol y/o polivinil alcohol (Zhao et al. 2005). Sin embargo, la plasmólisis excesiva y el choque osmótico también pueden tener efectos negativos sobre el tejido, provocando daños después de la descongelación y durante la regeneración (Wilkinson et al. 2003, Wang et al. 2005).

Técnicas de crioconservación

La crioconservación clásica incluye la deshidratación inducida en condiciones estériles en una cámara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los materiales (se utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40 °C, así como diferentes tiempos de permanencia en esas temperaturas), la inmersión en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el almacenamiento a –80 °C. Sin embargo, nuevas técnicas basadas en la eliminación parcial de agua en los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado parcialmente a la técnica clásica (Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005). Estas nuevas técnicas son: (1) vitrificación, (2) encapsulación – deshidratación, (3) encapsulación – vitrificación, (4) precrecimiento, (5) precrecimiento – deshidratación, (6) desecación y (7) enfriamiento de gotas (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).

1) Vitrificación

La vitrificación es un proceso que promueve la deshidratación celular y "solidificación" de líquidos en ausencia de cristalización (se evita la formación de cristales de hielo intracelulares que dañan los tejidos). Con la "solidificación" se induce un estado con una estructura molecular aleatoria pero que posee propiedades físicas y mecánicas similares a un sólido. Esta transición del agua líquida a una fase amorfa cambia la conformación estructural celular hacia una apariencia vidriosa (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Benson et al. 2006). La vitrificación es realizada previa al congelamiento por medio de una sustancia crioprotectante (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005).

Esta técnica se recomienda para órganos complejos, como ápices de tallos, tejidos embriogénicos y cultivos de células (Dixit et al. 2004, Zhao et al. 2005). Además de los compuestos usuales, mencionados anteriormente, en la solución crioprotectante se han adicionado también otras sustancias. Por ejemplo, proteínas anticongelantes como albúmina de suero bovino (BSA), epinefrina o el aminoácido prolina (PRO) para incrementar la sobrevivencia, una vez terminada la fase de crioconservación, en meristemas apicales de papa (Zhao et al. 2005). Wang y colaboradores (2005) desarrollaron un protocolo donde se utilizó PRO en la solución crioprotectante y se obtuvo una sobrevivencia de alrededor de 80% para explantes de los cultivares taiwaneses de papaya "Tai-nung, Red Lady y Florida". Otro agente crioprotectante es el Supercool X1000 (21st Century Medicine, Inc. USA), que es un polímero de alcohol de polivinilo, el cual tiene una funciónsimilar a las proteínas anticongelantes al inhibir la formación de hielo durante la crioconservación (Zhao et al. 2005).

Se ha encontrado que soluciones crioprotectantes, con productos como DMSO, pueden ser tóxicas para algunas especies tropicales. Por lo tanto, la mezcla de la solución crioprotectante y el producto debe ser cuidadosamente seleccionada (Dixit et al. 2004, Zhao et al. 2005). Una vez aplicada la solución líquida crioprotectante e inducida la vitrificación, los tejidos se congelan con NL. Posterior al tratamiento con la solución crioprotectante y el NL, los explantes son almacenados a ‑80 °C (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008).

Pennycooke y Towill (2000) utilizaron una mezcla crioprotectante de DMSO, sacarosa y glicerol durante 26 minutos a 22 °C para conservar ápices de tallo de camote (Ipomoea batatas) y lograron la regeneración, ocho semanas después del descongelamiento, con una sobrevivencia mayor al 80%.

Durante el descongelamiento, los explantes generalmente se colocan en un baño de María a 40 °C por uno a dos minutos y luego son lavados con medio de cultivo suplementado con sacarosa (0,4–1,2 M). Posteriormente, los explantes se colocan en el mismo medio de cultivo para su recuperación y regeneración en condiciones de adecuadas luz (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005, Sant et al. 2008).

La vitrificación en este contexto no debe ser confundida con el fenómeno de hiperhidricidad descrito anteriormente, ya que en artículos anteriores a 1992 se usaba el mismo término. Debergh et al. (1992) sugirieron el uso de la palabra hiperhidricidad en el segundo caso para evitar confusiones.

2) Encapsulación – deshidratación

La encapsulación - deshidratación se ha utilizado con ápices de tallo y tejidos embriogénicos. Los explantes se precultivan en una solución con concentración alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y luego son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG); después se les aplica una deshidratación en la cámara de flujo laminar (cuatro a cinco horas), se congelan con NL y se mantienen a -80 °C por el período de almacenamiento. El descongelamiento se realiza en baño de María a 40 °C por uno a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperación del crecimiento y regeneración (Ara et al. 2000, Dixit et al. 2004).

(3) Encapsulación – vitrificación

La encapsulación - vitrificación es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para la encapsulación. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los explantes en una solución con alta concentración de sacarosa, sino más bien por el uso de una solución crioprotectante (como se menciona en la primera técnica) a 0 °C por unas horas, en su lugar, y por haber sido usado específicamente para meristemas. Los meristemas son encapsulados en medios que contienen altas concentraciones de azúcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se congelan inmediatamente con NL y se mantie nen a -80 °C (Hi rai y Sa kai 2003, Dixit et al. 2004). El proceso de descongelamie nto es similar al utilizado en la técnica de encapsulación – deshidratación.

(4) Precrecimiento

El precrecimiento se ha utilizado específicamente para embriones cigóticos y somáticos. La técnica involucra el cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por varios días. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para luego almacenarlos a -80 oC. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica de encapsulación – deshidratación (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).

(5) Precrecimiento – deshidratación

En el precrecimiento - deshidratación se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se desecan en flujo de aire y se congelan directamente en NL. El proceso de descongelamiento es similar a la técnica mencionada para la vitrificación (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004). Esta técnica también ha sido utilizada con callos embriogénicos de yuca (Manihot esculenta) provenientes del Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en Colombia y del Instituto Internacional de Agricultura Tropical (International Institute of Tropical Agriculture [IITA]) en Nigeria. Los callos se trataron previamente con una solución crioprotectante alta en sacarosa, se deshidrataron y, posteriormente se congelaron con NL (Danso y Ford-Lloyd. 2004).

6) Desecación

La desecación se ha utilizado sólo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen y óvulos. En ella se realiza primero la desecación de los tejidos o semillas en una cámara de flujo laminar o en un aparato con aire comprimido estéril o en sílica gel y, luego se congelan las estructuras con NL (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004). Por ejemplo, en el caso de café, esta técnica permitió mantener la viabilidad de los embriones durante al menos un año (Kumar et al. 2006). En el caso de tejidos haploides, como por ejemplo el polen de palma aceitera, la desecación fue realizada por medio de vacío. El polen fue mantenido en almacenamiento durante ocho años y, posteriormente, se observó que al germinar presentó una viabilidad del 62%. Como comparador, este mismo polen se almacenó en frío (entre -10 y -20 °C) y a temperatura ambiente. En el primer caso, el polen permaneció viable durante un año y en el segundo caso, permaneció viable solamente durante siete días (Tandon et al. 2007).

7) Enfriamiento de gotas

En enfriamiento de gotas se ha realizado con ápices de tallos, los cuales son pretratados con una solución crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen gotas pequeñas de crioprotectante con el ápice en el centro. Los explantes se congelan directamente con NL (Dixit et al. 2004). Un ejemplo exitoso fue realizado con ápices de tallo de 18 cultivares de Colocasia esculenta (ñame). Los ápices fueron desecados previamente con flujo de aire estéril y colocados en un medio de cultivo MS suplementado con glicerol (2 M) y sacarosa (0,4 M). Luego, estos se colocaron en una solución crioprotectante que consistió de medio líquido MS con glicerol (3,26 M), etilén glicol (2,42 M), DMSO (1,9 M) y sacarosa (0,4 M). Gotas de este medio con los ápices de C. esculenta se colocaron sobre una superficie plana con papel de aluminio y fueron congeladas con NL. En esta investigación se obtuvo una tasa de regeneración de entre 73 y 100% (Sa nt et al. 2008).

Técnicas de cultivo de tejidos para el almacenamiento por largo plazo

Además de la crioconservación, también existe la posibilidad de almacenar tejidos in vitro por largo plazo sin el uso de NL, retrasando el crecimiento al controlar factores como el estrés osmótico del medio (Bessembinder et al. 1993). Esto se logra utilizando azúcares no metabolizables por las plantas como el manitol o el sorbitol. Adicionalmente, se puede usar reguladores de crecimiento que reduzcan la tasa de crecimiento y bajas temperaturas. Bessembinder et al. (1993) mantuvieron clones de C. esculenta durante ocho años a 9 °C, con ciclos de transferencia cada tres años. En otro ejemplo, se mantuvieron los meristemos de cultivares comerciales de banano almacenados entre 28 y 30 meses en medios de cultivo con la mitad de la concentración de las sales minerales, a 22 oC con un fotoperiodo de 16 horas luz y transferencia cada dos meses (Banerjee y Sharma 1988). Sin embargo, es importante señalar que tiempos mayores de cultivo in vitro podrían inducir tasas más altas de variación somaclonal (Sánchez-Chiang y Jiménez 2009).

Bancos de germoplasma in vitro en cultivos tropicales

La mayoría de los bancos de germoplasma in vitro especializados en plantas tropicales se encuentran asociados a centros internacionales de investigación o conservación y, en menor grado, a universidades. Un ejemplo es el Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE), en Costa Rica, donde se ha trabajado en el desarrollo de protocolos adecuados para el almacenamiento in vitro de embriones cigóticos, embriones somáticos, ápices y semillas de diferentes genotipos de café, así como de suspensiones celulares de esta misma especie y de Musa spp. Esto, además, ha facilitado el intercambio de recursos fitogenéticos con productores y con organismos internacionales (Etienne et al. 2002, Ebert 2008).

El CIAT ha conservado maíz (Zea mays) (CIAT 2008), el Centro de Internacional de la Papa (CIP) variedades locales de papa, el IITA frijol ñame (Sphenostylis stenocarpa), caupí (Vigna unguiculata), maní bambara (Vigna subterranea), soya (Glicinemax) y yuca (Ebert 2008, IITA 2008). También, institutos miembros del Grupo Consultivo de Investigación en Agricultura Internacional (The Consultative Group on International Agricultural Re search [CGIAR]), que colaboran con organismos oficiales en diferentes zonas de Medio Oriente, América, Asia y África, se dedican principalmente a la investigación científica para fomentar el crecimiento agrícola sostenible que fortalezca la seguridad alimentaria y como tarea fundamental tienen el mantener bancos de germoplasma internacionales que preservan y facilitan el acceso a los recursos genéticos (CGIAR 2009).

También, el grupo Biodiversidad Internacional (Biodiversity International [BI], anteriormente conocido como "The International Board for Plant Genetic Resources" [IBPGR]), con sus diferentes sedes de América, Asia, el Pacífico, Oceanía, Europa y África, se ha centrado en la conservación in vitro, por medio del crecimiento lento, de tallos de cacao, mango, banano, plátano, aguacate, papa (proveniente del CIP por intercambio de materiales), yuca, especies de Allium, minitubérculos de ñame (Dioscorea spp.) (provenientes del IITA), tiquisque (Xanthosoma spp.) y malanga, taro, chamol o ñampí (C. esculenta) y algunas especies forrajeras (Cynodon spp. y Digitaria spp.). Además, BI ha empleado la crioconservación para almacenar embriones cigóticos de coco, semillas de cacao, semillas de aguacate, meristemos de camote y papa, explantes de caña de azúcar (Saccharum officinarum) y Citrus spp. (Withers et al. 1990, Engelmann 1991, Biodiversity International 2008a, 2008b, CIAT 2008). En cuanto a cultivos básicos para la alimentación en África y Asia, se ha trabajado principalmente con Allium spp., maíz y arroz (Withers et al. 1990).

La Red Internacional para el Mejoramiento de Banano y Plátano (por su nombre en inglés "Internacional Network for the Improvement of Banana and Plantain [INIBAP/IPGRI], Bélgica) se especializa en mantener un banco de germoplasma in vitro de banano y ha hecho esfuerzos por eliminar enfermedades durante su almacenamiento. Por ejemplo, por medio de la crioconservación se eliminó el virus del mosaico del pepino en meristemas apicales de esta especie (Helliot et al. 2003).

Las universidades de Taiwán y Camboya establecieron un banco de germoplasma in vitro de cítricos, en conjunto con el Centro Long Dinh de Investigación en Fruticultura (LDFRC, por sus siglas en inglés) en Vietnam (Su 2006). A partir de recursos fitogenéticos conservados en este banco se generaron nuevas variedades con tolerancia y resistencia a varias enfermedades. El banco posee 15 variedades de naranja, 11 variedades y cinco especies silvestres de limón, 45 variedades de pomelo y más de 27 variedades pertenecientes a seis especies e híbridos (Food and Fertilizer Technology Center 1997). Un año después, dicho proyecto se amplió hacia la producción de banano libre de virus (Food and Fertilizer Technology Center 1998, Hwang y Su 1998).

En Asia, el Centro de Tecnología en Alimentos y Fertilizantes (Food and Fertilizer Technology Center [FFTC]) utiliza un banco de germoplasma para salvar de la extinción materiales silvestres de arroz y banano y así poder utilizarlos en programas de mejoramiento genético (Food and Fertilizer Technology Ce nter 2001).

El Gobierno de India, por su parte, ha establecido una red entre tres bancos de germoplasma nacionales: el Jardín Botánico e Instituto de Investigación Tropical (TBGRI, por sus siglas en inglés) en Thiruvananthapuram, el Instituto Central de Medicina y Plantas Aromáticas (CIMAP, por sus siglas en inglés) en Lucknow y la Oficina Nacional de Recursos Genéticos Vegetales (NBPGR, por sus siglas en inglés) en Nueva Delhi, los cuales tienen programas de conservación en especies de plantas medicinales, enfocados fuertemente en la crioconservación (Dixit et al. 2004).

Existen otros esfuerzos más pequeños y limitados, que también se enfocan en cultivos tropicales y que procuran la seguridad alimentaria y el desarrollo de metodologías para especies poco investigadas, como la crioconservación de varias especies del género Dioscorea (con potencial como substituto de la papa) en el Instituto de Genética de Plantas e Investigación en Cultivos Vegetales, Gatersleben, Alemania (Leunufna y Keller 2003), meristemas apicales de camote en el Instituto de Biotecnología Kagoshima, Japón (Hirai y Sakai 2003), y tallos de caña de azúcar provenientes de embriones somáticos por medio de crecimiento lento in vitro con subcultivos cada dos meses en el laboratorio de conservación de germoplasma de la Escuela de Biología y Ciencias de la Conservación de la Universidad de KwaZulu- Natal, en África del Sur (Watt et al. 2009).

Los bancos de germoplasma in vitro también permiten la conservación de semillas de ciertos híbridos tropicales. Por ejemplo, Popova et al. (2003) crioconservaron, en el Jardín Botánico de la Academia Rusa de Ciecias, semillas del género híbrido de orquídeas Bratonia (Miltonia x Brassia) y encontraron que esta metodología fue beneficiosa para el desarrollo de los protocormos y que las semillas no perdieron viabilidad. También, en el Instituto Embrapa Gado de Leite en Brasil, se logró el almacenamiento por 90 días en cultivo in vitro de algunas variedades de las gramíneas forrajeras Pennisetum purpureum (Cameroon, Mi neiro, Pioneido y un híbrido triploide – P. purpureum x P glaucum) (Souza sobrinho et al. 2007).

Como se destaca en esta revisión de literatura, los bancos de germoplasma in vitro son una herramienta útil para la conservación de recursos genéticos de cultivos tropicales de importancia agrícola y alimenticia.

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