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Odontología Vital

On-line version ISSN 1659-0775Print version ISSN 1659-0775

Odontología Vital  n.31 San Pedro, Lourdes de Montes de Oca Jul./Dec. 2019

 

Artículo

Efecto antibacteriano y antioxidante de frutos rojos ecuatorianos sobre streptococcus mutans: estudio in vitro

Antibacterial and antioxidant effect of ecuadorian red fruits on streptococcus mutans: in vitro study

Ivonne Yesenia Reyes Pillajo1 

Clara Elena Villacres2  

Stalin Gustavo Santacruz Terán3 

Marlon Reinaldo Castro García4 

María Fernanda Chávez Campuzano5 

Ana Del Carmen Armas Vega6 

1Universidad Central del Ecuador, Ecuador, i_vonlove@hotmail.com.

2Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, Ecuador, stalin.santacruz@gmail.com.

3Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, Ecuador, marlon.cg22@hotmail.com.

4Ministerio Agricultura y Ganadería, Ecuador, elenavillacres9@hotmail.com.

5Dentimagen Centro Odontológico, Ecuador, maferchavez21@gmail.com.

6Universidad Central del Ecuador, Ecuador, ana_del_ec@yahoo.es.

Resumen

Objetivo:

Evaluar mediante cuantificación de halos de inhibición el efecto antibacteriano de la cáscara y pulpa del capulí (Prunus serotina capulí) y del mortiño (Vaccinium floribundum), sobre cepas de Streptococcus mutans (ATCC 35668) a las 24 y 48 horas, comparado con arándano deshidratado y gluconato de clorhexidina al 0,12%.

Materiales y métodos:

Estudio experimental transversal in vitro, 15 cajas petri fueron utilizadas para sembrar 20ml de cultivo de cepas de Streptococcus mutans. En cada caja fueron colocados discos de fieltro impregnados con 20 μl de las sustancias evaluadas; mortiño y capulí, en pulpa y en cáscara, arándano deshidratado y gluconato de clorhexidina al 0,12% como control, distribuidos a una distancia equidistante. El análisis del efecto antibacteriano se realizó midiendo la zona de inhibición en un tiempo de 24 y 48 horas de incubación, los datos obtenidos se analizaron estadísticamente en el programa SPSS 22 mediante las pruebas paramétricas y de Kruskal Wallis.

Resultados:

No existió diferencia estadística significativa entre las variables analizadas, capulí y mortiño tanto en cáscara como en pulpa y clorhexidina empleada como control, en los dos períodos evaluados (p= > 0,05).

Conclusiones:

Los frutos rojos analizados tienen un efecto antibacteriano a las 24 y 48 horas, lo cual guarda relación con su capacidad antioxidante.

Palabras clave: Clorhexidina; frutos; Streptococcus mutans

Abstract

Objective:

To evaluate by quantification of halos of inhibition, the antibacterial effect of the shell and pulp of capulí, (Prunus serotina capuli) and mortiño (Vaccinium floribundum), on strains of Streptococcus mutans (ATCC 35668) at 24 and 48 hours, compared with dehydrated cranberry and chlorhexidine gluconate at 0,12%.

Materials and methods:

In vitro cross-sectional experimental study, 15 petri dishes were used to plant 20 ul of the evaluated substances were placed in each box, mortiño, and capuli, in pulp and in shell, dehydrated cranberry and 0,12% chlorhexidine gluconate as control, distributed at an equidistant distance. The analysis of the antibacterial effect was performed by measuring the zone of inhibition in a time of 24 and 48 hours of incubation, the dataobtained were statistically analyzed in the SPSS 22 program by parametric and Kruskal Wallis tests.

Results:

There was no significant statistical difference between the analyzed variables, capuli and mortiño, both in skin and pulp and chlorhexidine used as control, in the two evaluated periods of time (p=>0,05).

Conclusions:

The red fruits analyzed have an antibacterial effect 24 and 48 hours, which is related to its antioxidant capacity.

Key words: Chlorhexidine; red fruits; Streptococcus mutans

Introduction

La caries dental y las enfermedades infecciosas en la cavidad bucal son producidas por microorganismos, lo cual conlleva a problemas de salud que afectan a la población en general1. Se define a la caries dental como un desarrollo patológico localizado que ocasiona el reblandecimiento del tejido dental de forma irreversible2, asociado al desequilibrio del metabolismo bacteriano3 donde el microorganismo obtiene energía de los alimentos ingeridos, descomponiendo en una amplia gama de carbohidratos al presentar flexibilidad genética1, 2. Otros elementos que utiliza son la fructosa, galactosa, maltosa, almidón y sacarosa, formados por monosacáridos simples, fructosa y glucosa2, que la bacteria descompone convirtiéndolos en subproductos, ácido láctico y etanol que acidifica la boca4, y a los subproductos ácidos producidos por la fermentación de los carbohidratos consumidos en la dieta e higiene5,6, desarrollando la presencia de caries dental y con ello la disminución de la calidad de vida de quien la presenta7.

La lesión cariosa es una de las enfermedades multifactoriales más prevalente y común en los seres humanos, de tal forma que uno de los factores que desarrollan esta enfermedad son los microorganismos, y parte de ellos es el Streptococcus mutans, que se presenta por una ruptura en el ecosistema bucal, pero al probar con estas sustancias lo que se pretende es encontrar un componente natural que permita alcanzar una armonización en este ecosistema, sin afectar otros elementos, y con esto conseguir que los procesos de caries dental se detengan.

La fitoterapia asocia los compuestos fenólicos presentes en diferentes frutos rojos8,9 con efectos antioxidantes, antimicrobianos y antiadhesivos10,11, y se emplea como agente coadyuvante químico el gluconato de clorhexidina12, con limitaciones con respecto a la pigmentación asociada a largos períodos de uso13 y resistencia que el microorganismo desarrolla14.

El mortiño, (Vaccinium floribundum), conocido como agraz o arándano, pertenece a la familia Ericaceae, es una fruta nativa del Ecuador, llamada también uva de monte, que se encuentra ubicada en los páramos ecuatorianos. Sus propiedades alimenticias se encuentran asociadas a la presencia de minerales, vitaminas de complejo B, C, antioxidantes relacionados con la presencia de antocianinas como cianidina y delfinidina, también metabolitos secundarios encargados de su actividad antioxidante con efectos antiproliferativos y cardioprotectores15,16, lo que le convierte en un fruto ideal en industrias, campo médico y culinario15,17. El capulí, (Prunus serótina capuli spp (Cav) Mc. Vaug Cav), pertenece a la familia de las Rosaceae; probablemente originario de México, comercializado en mercados ecuatorianos, su fruta es de forma esférica de 1.5-2 cm de diámetro, de sabor agridulce con cáscara rojo oscuro, de textura firme y su pulpa verde pálido, empleado como alimento en la creación de bebidas y helados18. Presenta actividad antibacteriana y antioxidante con efectos sobre inflamación respiratoria o gastrointestinal19. Entre los compuestos fenólicos presentes en esta fruta están flavonoides y taninos, donde se destacan antocianinas cianuro-3-glucósido y cianuro- 3-rutinosido con gran capacidad antioxidante20,21.

Si bien de forma fisiológica, en la superficie de los dientes se produce una fina película o biofilm22,23 dentario sobre la cual se desarrollan procesos de adherencia microbiana con el subsecuente establecimiento de la caries como lesión, para cuyo control se han desarrollado diferentes agentes antiadhesivos23. Los compuestos de los frutos rojos han mostrado beneficios potenciales en la prevención de problemas infecciosos, impidiendo la propagación de bacterias en la cavidad bucal22, por sus propiedades antibióticas y antisépticas, pudiendo ser una opción adecuada en los procesos de fijación de las bacterias en la cavidad bucal por el mecanismo de antiadhesión22.

Con estos antecedentes, este estudio tiene el objetivo de evaluar la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos presentes en el mortiño y capulí, así como mediante pruebas microbiológicas in vitro, el efecto de inhibitorio de los extractos de las frutas antes mencionadas sobre cepas de Streptococcus mutans ATCC 35668.

Materiales y métodos

Se planteó un estudio experimental, donde mortiño y capulí, obtenidos del mercado de Ambato-Ecuador, fueron separados de su cáscara como de su pulpa, obteniéndose 30g de cada uno de ellos.

De la misma manera una cantidad similar de arándano previamente deshidratado (marca Nature´s Heart Passion Cherry, supermercado “Megamaxi” de Quito), fue pesada (balanza analítica Sartorius TE6101, Germany) y mezclada con 5ml de agua destilada, de forma independiente para hacer una pasta homogénea con cada uno de ellos.

La pasta obtenida fue posteriormente triturada en un mortero y se elaboró un líquido que fue colocado en tubos de 15ml para luego ser centrifugados (Sigma 2-16p, Germany) por 5 min a 4000 rpm.

De forma conjunta las cepas puras de Streptococcus mutans ATCC 35668, obtenidas del importador MEDIBAC, fueron activadas en caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth C5141 Criterion, USA), las cuales fueron manipuladas por personal especializado y capacitado del Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.

Se preparó 15 cajas Petri con 20 mL de medio de cultivo agar sangre de base incubadas a una temperatura de 37ºC durante un periodo 48 horas en microaerofília para su propagación. Finalmente por cada cepa se preparó una suspensión bacteriana al 0,5 Mc Farland. Para medir si las cepas se reprodujeron en el tiempo correcto, se realizaron lecturas de absorbancia (Jenway 6320D, Germany) a 625 nm de longitud de onda a 24 y 48 horas de incubación, y se verificó que la medida de absorbancia obtenida sea directamente proporcional a la concentración de los microorganismos presentes, correlacionando la medida de absorbencia con la concentración de microorganismos se utilizó un patrón 0,5 Mc Farland que representó una concentración conocida de microorganismos, la cual es de 1,5 x 108 UFC.

En las lecturas se utilizó un pozo blanco, el cual contiene caldo BHI virgen, esa lectura debe ser restada a las lecturas realizadas para eliminar la absorbancia procedente del caldo BHI. En cada una de las cajas fueron depositados 6 discos de papel filtro (FishEr Scientific Q2) de 5 mm de diámetro, embebidos con 20 μl de cada uno de los extractos mortiño en pulpa y cáscara, capulí en pulpa y cáscara, arándano deshidratado y gluconato de clorhexidina al 0,12%, estos dos últimos empleados como control. La medición de la zona de inhibición se realizó con una regla calibrada (en mm) a las 24 y 48 horas de incubación.

La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos totales presentes en las muestras se midió por medio del ensayo TEAC modificado, usando la decoloración por el radical catión ABTS y expresada finalmente como mg Trolox/g muestra (Re et ál., 1999)24. Además se consideró A x 250,29= (uM eq)/ (peso muestra = (ugtroloxeq”” )/g y 3 repeticiones por sustancia empleado el ABTS y 3 repeticiones por sustancia sin usar el ABTS.

El radical ABTS se preparó mediante la reacción acuosa de persulfato de potasio 2,45 mM y ABTS 7 mM.

La solución se dejó reposar en la oscuridad por 16h a 20°C. La solución de ABTS obtenida es estable durante dos días y se diluye con etanol (95%) hasta obtener una absorbencia de 0,70 (± 0,1) a 734 nm 30°C. Se mezclan 2ml de la solución de radical ABTS, y se registra su absorbencia a 734 nm, luego se añade 20 μL de la muestra y se mide su absorbencia luego de 6 min. Para la cuantificación de la actividad antioxidante se utiliza la diferencia de absorbencias, un blanco de etanol y una curva de calibración usando Trolox como estándar.

Los datos estadísticos fueron tabulados en el programa SPSS 22 y se realizó pruebas de normalidad según Kolmogorov - Smirnov y Shapiro- Wilk y de Kruskal Wallis.

Resultados

El estudio consideró la capacidad inhibitoria del mortiño, capulí y de la clorhexidina como control positivo, en 15 cajas Petri con la evaluación a las 24 y 48 horas, mediante la medición de la zona de inhibición, y se mostró que mientras mayor es el diámetro de la zona de inhibición, existe un mayor efecto de la sustancia sobre la bacteria estudiada.

En el análisis descriptivo de los datos considerando los dos tiempos de evaluación de la capacidad de inhibición se evidencia que la cáscara de mortiño presentó el mayor halo de inhibición, seguido de la clorhexidina. (Tabla 1).

En la tabla 2, se observan diferencias entre las distintas sustancias, mayores valores en la cáscara del mortiño (13,71) y clorhexidina (11,73), entre los valores más bajos se tiene la cáscara de capulí (6,88).

A las 48 horas de incubación, también se observa que la cáscara del mortiño tiene un mayor valor real de inhibición del microorganismo que el resto de frutos rojos evaluados, y la clorhexidina también presentó un halo de inhibición superior a los demás. (Tabla 3)

Además se muestran diferencias entre las distintas sustancias, mayores valores en la cáscara de mortiño (17,20) y clorhexidina (17,43), entre los valores más bajos se tiene la cáscara de capulí (8,54), y para verificar si existe diferencia significativa se hacen las respectivas pruebas no paramétricas, donde no se observa diferencia significativa. (Tabla 4).

Tabla 1. Valor real de halo de inhibición de los frutos rojos a las 24 horas. 

N Media Desviación Valor real de halo de inhibición
Estándar Mínimo Máximo
MORTIÑO PULPA 15 9,367 2,5581 6,8089 11,9251
MORTIÑO CÁSCARA 15 13,713 3,5292 10,1838 17,2422
CAPULÍ CÁSCARA 15 6,88 2,4249 4,4551 9,3049
CAPULÍ PULPA 15 9,82 4,1876 5,6324 14,0076
ARÁNDANO DESHIDRATADO 15 8,773 1,417 7,356 10,19
CLORHEXIDINA 15 11,727 0,9208 10,8062 12,6478
Total 90 10,047 3,4515 6,5955 13,4985

Tabla 2. Descriptivos en el periodo de las 24 horas. 

N Media Desviación estándar Error Estándar Mínimo Máximo
MORTIÑO PULPA 15 9,367 2,5581 0,6605 6,3 15,0
MORTIÑO CÁSCARA 15 13,713 3,5292 0,9112 8,0 21,3
CAPULÍ CÁSCARA 15 6,880 2,4249 0,6261 0,00 11,7
CAPULÍ PULPA 15 9,820 4,1876 1,0812 0,0 15,7
ARÁNDANO DESHIDRATADO 15 8,773 1,4170 0,3659 7,0 11,3
CLORHEXIDINA 15 11,727 0,9208 0,2377 10,7 13,7
Total 90 10,047 3,4515 0,3638 0,0 21,3

Tabla 3: Estadísticos descriptivos 48 horas. 

N Media Desviación Valor real de halo de inhibición
Estándar Mínimo Máximo
MORTIÑO PULPA 15 11,393 2,5697 8,8233 13,9627
MORTIÑO CÁSCARA 15 17,2 3,2127 13,9873 20,4127
CAPULÍ CÁSCARA 15 8,54 2,869 5,671 11,409
CAPULÍ PULPA 15 12,22 4,6498 7,5702 16,8698
ARÁNDANO DESHIDRATADO 15 11,207 1,6029 9,6041 12,8099
CLORHEXIDINA 15 17,433 11,5868 5,8462 29,0198
Total 90 12,999 6,2927 6,7063 19,2917

Tabla 4 Descriptivos en el periodo de las 48 horas. 

N Media Desviación estándar Error Estándar Mínimo Máximo
PULPA MORTIÑO 15 11,393 2,5697 0,06635 8,3 17,3
CÁSCARA MORTIÑO 15 17,200 3,2127 0,08295 11,7 25,3
CÁSCARA CAPULÍ 15 8,540 2,8690 0,07408 0,0 12,7
PULPA CAPULÍ 15 12,220 4,6498 0,12006 0,0 18,0
ARÁNDANO DESHIDRATADO 15 11,207 1,6029 0,04139 9,0 14,3
CLORHEXIDINA 15 17,433 11,5868 0,29917 13,7 59,3
Total 90 12,999 6,2927 0,06633 0,0 59,3

Tabla 5 Prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. 

Kolmogorov-Smirnov
Estadístico Gl Sig.
MORTIÑO PULPA 24 horas 0,1900 15 0,1480
MORTIÑO PULPA 48 horas 0,1450 15 0,2000
MORTIÑO CÁSCARA 24 horas 0,1680 15 0,2000
MORTIÑO CÁSCARA 48 horas 0,1350 15 0,2000
CAPULÍ CÁSCARA 24 horas 0,2920 15 0,0010
CAPULÍ CÁSCARA 48 horas 0,2560 15 0,0090
CAPULÍ PULPA 24 horas 0,1260 15 0,2000
CAPULÍ PULPA 48 horas 0,1820 15 0,1920
ARÁNDANO DESHIDRATADO 24 horas 0,2420 15 0,0180
ARÁNDANO DESHIDRATADO 48 horas 0,1810 15 0,2000
CLORHEXIDINA 24 horas 0,1340 15 0,2000
CLORHEXIDINA 48 horas 0,5270 15 0,0000

Tabla 6. Prueba de dos en dos considerando 24 horas de evaluación 

Tabla 7. Prueba de dos en dos considerando las 48 horas de evaluación. 

Gráfico 1: Actividad antioxidante hidrofílica 

Los datos sometidos a la prueba de normalidad de Kolmogorov- Smirnov, (tabla 5), evidencian que la distribución de datos no es normal y, por lo tanto, se someten a análisis mediante la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis.

La prueba de Kruskal-Wallis reveló que no todas las medias de las muestras son similares, por lo cual se realizó la prueba dos a dos, considerando los dos tiempos de evaluación, por separado. (Tabla 6 - 7).

En este análisis realizado resultó evidente que las cáscaras de capulí y de mortiño, son las sustancias que difieren en relación con las otras en los dos tiempos de evaluación ejecutados (p=0,00).

Para completar el análisis, tanto mortiño como capulí fueron sometidos a análisis de la cantidad de antioxidantes de los compuestos fenólicos presentes en los dos frutos rojos. Los datos fueron evaluados mediante un análisis estadístico descriptivo, que reveló mayores valores de actividad antioxidante para la cáscara del mortiño (19284 ug trolox eq/g) seguido por la cáscara de capulí (10452 ug trolox eq/g). (Gráfico 1).

Discusión

Los frutos rojos mortiño y capulí en cascara, obtuvieron valores de inhibición sobre el crecimiento de cepas de Streptococcus mutans ATCC 35668, semejantes a gluconato de clorhexidina al 0.12% empleada como control tanto a las 24 y 48 horas, coincidiendo con estudios previos que refieren que los frutos rojos empleados por su capacidad antioxidante muestran un destacado efecto anticancerígeno25, antienvejecimiento26, antimicrobiano, lo que ha llevado a pensar en su capacidad de actuar sobre cepas de microorganismos que producen enfermedades a nivel bucal como caries dental, lo que guarda relación con el hecho de que los frutos rojos tienen una elevada capacidad antimicrobiana27.

De los frutos evaluados, el mortiño (vaccinium meridionale)28 resulta muy semejante al arándano, el cual reporta en la literatura un efecto antioxidante importante29 asociado a la presencia de flavonoides30, ya ha sido empleado a nivel odontológico31 con resultados

interesantes corroborados en este estudio, sin embargo el capulí perteneciente a la familia Prunus serótina subsp capulí28, es un fruto típico de la zona andina del Ecuador sobre el cual no existen estudios, sin embargo como evidencia este estudio, merece ser considerado al encontrar un desempeño muy semejante a la clorhexidina empleada como control, resultados que estarían asociados a los compuestos fenólicos presentes, y que deben ser investigados en estudios futuros.

Si bien los resultados muestran una acción in vitro, positiva de estas sustancias es necesario resaltar que estas fueron trituradas buscando simular lo que ocurre en boca al mezclar con saliva, considerando todos los elementos obtenidos en un solo extracto sin evaluarlos de forma separada, lo que consideramos merece realizarse y complementarse con lo ejecutado y reportado32 sobre todo en lo referente a la capacidad antioxidante del mortiño33, esta ausencia de diferencia significativa entre las dos sustancias probadas, mortiño y capulí con la clorhexidina al 0,12% tras diluirla en agua destilada, empleada como control, vale la pena evaluar a lo largo del tiempo así como las consecuencias de su empleo, buscando siempre el más alto beneficio para el paciente.

Conclusiones

Los frutos rojos mortiño y capulí, tanto en pulpa como en cáscara, obtuvieron valores de inhibición sobre el crecimiento de cepas de Streptococcus Mutans ATCC 35668, semejantes a gluconato de clorhexidina al 0.12% empleada como control, tanto a las 24 y 48 horas de evaluación.

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Autores

1Ivonne Yesenia Reyes Pillajo1, Stalin Santacruz2, Marlon Castro3, Clara Elena Villacres4, María Fernanda Chávez Campuzano5, Ana Del Carmen Armas Vega6

2 1. Odontóloga Universidad Central del Ecuador, ivonlove@hotmail.com

3 2. PhD en Ciencia de Alimentos, Docente Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí, stalin.santacruz@gmail.com

4 3. Microbiólogo, Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí

5 4. Máster en ciencias, Ministerio Agricultura y Ganadería

6 5. Especialista en Rehabilitación oral y Disfunción Temporomandibular y Dolor Orofacial, maferchavez21@gmail.com

7 6. PhD en Odontología, Docente Universidad Central del Ecuador, ana_del_ec@ yahoo.es.

8Correspondencia: María Fernanda Chávez Campuzano maferchavez21@gmail.com Luis alcivar OE4-140 y Avenida Brasil 2248-326/ 0987453553 ECUADOR

Recibido: 04 de Junio de 2018; Aprobado: 15 de Marzo de 2019

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