Introducción
Los carbapenémicos son antimicrobianos que pertenecen a la familia de las betalactamas. Son de uso extendido en la clínica debido a su estabilidad, amplio espectro y a que pueden utilizarse en variedad de infecciones, ya sea en sistema nervioso central, tracto respiratorio inferior, piel, tracto urinario y tejidos blandos, entre otros (1).
Las carbapenemasas de Klebsiella pneumoniae (KPC) son betalactamasas de clase A capaces de inactivar penicilinas, cefalosporinas, aztreonam y carbapenémicos. Los genes que codifican estas enzimas usualmente están localizados en elementos genéticos móviles, como plásmidos y transposones, lo cual aumenta el riesgo de transferencia lateral a otras bacterias, incluso a nivel interespecie (2,3).
El primer reporte de KPC en aislamientos de K.pneumoniae se dio en Estados Unidos en el 2001. Posteriormente se ha documentado la diseminación de K.pneumoniae productoras de KPC hacia Israel, Colombia, Brasil, Argentina, China y Europa (3,4). En Costa Rica la primera alerta de confirmación se dio el 28 de octubre del 2011 por el Centro Nacional de Referencia en Bacteriología y corresponde a la cepa del presente estudio.
En este trabajo, se encontró una cepa de K. pneumoniae resistente a carbapenemasas aislada de una paciente pediátrica que presentaba un cuadro de sepsis urinaria en el Servicio de Pediatría del Hospital de San Carlos. Se analizaron los mecanismos de resistencia y se confirmó la primera alerta a nivel nacional de una KPC-1.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas. La cepa a estudiar fue aislada de una paciente con infección urinaria del Servicio de Pediatría del Hospital San Carlos. La identificación del aislamiento fue confirmado utilizando el Vitek 2, Biomerieux. La cepa utilizada como control positivo para la corrida de PCR fue la KPC (ATCC BAA-1705) y la utilizada como control negativo la KPN (ATCC 700603). La cepa control positivo para la prueba con ácido borónico utilizada fue la K. pneumoniae OPS161 suministrada por el Centro Nacional de Referencia en Bacteriología (CNRB) del INCIENSA. La cepa utilizada para la prueba de Hodge es la E. coli ATCC 25922
Pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Se realizó por medio del Vitek 2 (Biomerieux, Francia).
Detección fenotípica de carbapenemasas clase A por ácido borónico. Se utilizó el método recomendado por Jiménez, Tijerino y Vargas (5). La confirmación estuvo a cargo del Centro Nacional de Referencia en Bacteriología (CNRB) del INCIENSA.
Test de Hodge Modificado. Se utilizó el método recomendado por el Centro de Control de Enfermedades (CDC). Esta prueba estuvo a cargo del CNRB del INCIENSA. (6)
Confirmación molecular de la presencia de KPC mediante PCR-RT. La identificación genotípica se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Nacional de Niños. Para la extracción de ADN se preparó una suspensión en 500 μl de PBS a partir de una colonia en cultivo puro. Se extrajo el ADN utilizando tecnología de partículas magnéticas mediante el equipo MagNAPure (Roche), a un volumen de elución de 100 μl. Para la amplificación se realizó en un ciclador Veriti (Applied Biosystems) a un volumen de 25 μl, con TaqPol (Fermentas) 1.25 U, 200 nM de dNTPs (Master Mix 2X), primers (Applied Biosystems) al 0,5 μM cada uno, y 1 μL del ADN extraído en el punto anterior. Para la detección, los productos amplificados fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5% con Bromuro de Etidio. Se utilizó marcador de peso molecular (50 pb) y el peso esperado del gen es de 331 pb.
Los primers utilizados para el blaKPC fueron dos. El 1 (Secuencia 5′-TGT CAC TGT ATC GCC GTC-3′) y el 2 (Secuencia 5′-TAT TTT TCC GAG ATG GGT GAC-3′).
Resultados
Prueba de sensibilidad a los antibióticos El hallazgo más importante fue la sensibilidad reducida a carbapenémicos (imipenem 4 μg/mL, meropenem 1 μg/mL), lo cual hace sospechar de una carbapenemasa, como se indica en la Tabla 1. Además, se observa que la cepa es resistente a múltiples antibióticos.
Detección fenotípica de carbapenemasas clase A por ácido borónico La prueba de ácido borónico muestra deformación de los halos de inhibición de carbapenemes en presencia de ácido borónico, lo cual sugiere la presencia de carbapenemasas (Figura 1).
Test de Hodge Modificado En el Test de Hodge Modificado se observa la formación las rosetas y el crecimiento de la cepa control en torno a discos de carbapenemes, sugiriendo la producción de carbapenemasas por la cepa en estudio (Figura 2).
Confirmación molecular de la presencia de KPC mediante PCR La PCR confirmó la presencia del gen blaKPC, lo cual ratificó que el aislamiento corresponde a una Klebsiella pneumoniae carbapenemasa positiva de tipo 1 (Figura 3).
Discusión
En el presente estudio se confirmó la primera alerta a nivel nacional de Klebsiella pneumoniae KPC-1, como aislamiento de una infección del tracto urinario en una niña con problemas hepáticos. Esto se pudo realizar luego de la sospecha de una cepa KPC positiva, según los lineamientos sugeridos por el CNRB, así como la confirmación fenotípica y genotípica descrita.
La emergencia y diseminación de Klebsiella pneumoniae KPC es una amenaza para los pacientes internados y un posible riesgo para los de la comunidad. Estas bacterias usualmente son resistentes a múltiples antibióticos y los mecanismos de resistencia son de fácil diseminación por medio de plásmidos (3).
Los hospitales constituyen un escenario que permite la propagación de estos mecanismos de resistencia. Factores que contribuyen a este proceso son estadía prolongada de pacientes de alto riesgo como extremos etarios, respiración mecánica asistida, inmunosupresión, cateterización, hospitalizaciones recurrentes y previas terapias antimicrobianas, así como la posibilidad de contaminación cruzada o diseminación a otros sitios en pacientes trasladados o que se dan de alta (7, 8, 9). Este es el caso de la paciente en cuestión, la cual tenía 1 año de edad y hospitalizaciones recurrentes por su problema hepático, además de previas terapias antimicrobianas a causa de las infecciones urinarias a repetición.
Cepas de Klebsiella pneumoniae y otras Enterobacterias sospechosas de KPC han sido estudiadas en diferentes hospitales del mundo y se ha reportado la presencia de carbapenemasas en porcentajes variables de los aislamientos que van desde menos del 1% hasta más de 40% (8, 10, 11). Además, la diseminación de bacterias con enzimas KPC ha desencadenado serios problemas terapéuticos y aumento de la mortalidad hasta en un 47% de los casos (12).
Los carbapenémicos, debido a su amplio espectro de actividad contra la mayoría de β-lactamasas, generalmente representan el último recurso para el tratamiento de infecciones nosocomiales producidas por bacterias Gram negativas multi-droga-resistente (13). En el caso de encontrarse resistencia a estos antibióticos, se recurre a tigeciclina y colistina. Sin embargo, es preocupante la reciente emergencia de cepas resistentes también a estos antibióticos (14).
Para evitar la emergencia y diseminación de cepas resistentes se recomienda un uso consciente de los antibióticos, buena higiene hospitalaria, aislamiento en casos sospechosos y vigilancia epidemiológica por parte de grupos interdisciplinarios.
Además, debe tenerse en cuenta el papel de la educación continua, tanto de los profesionales involucrados en el diagnóstico y tratamiento, como de los pacientes que reciben estas terapias.
Conclusiones
Se confirmó la primera alerta a nivel nacional de Klebsiella pneumoniae KPC-1, como aislamiento de una infección del tracto urinario en una niña con problemas hepáticos.
Los lineamientos del CNRB para sospechar de KPC, las pruebas fenotípicas de ácido borónico Y Hodge modificado y la confirmación molecular fueron útiles como protocolo para corroborar la carbapenemasa
Agradecimientos
Al Centro Nacional de Referencia en Bacteriología y al Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Nacional de Niños, por su colaboración en la confirmación del hallazgo.
Se muestra el fenotipo de resistencia a antibióticos de la cepa aislada, resaltando las concentraciones mínimas inhibitorias que hacen sospechar de una KPC