Introducción

En los últimos diez años, el aumento en la incidencia en las infecciones fángicas, ha sido atribuido al desmedido uso de nuevos y más efectivos agentes antimicrobianos, a la epidemia del SIDA y a la expansión del número de pacientes imnunosuprimidos que han sido inducidos químicamente, tal y como son los pacientes de oncología hematología y transplantados de médula ósea (1).

Hoy día, los agentes micóticos, son importantes patógenos nosocomiales y causan una elevada morbilidad y mortalidad entre los pacientes hospitalizados. Según datos del Sistema de Vigilancia Nacional de Enfermedades Nosocomiales la razón de enfermedades con etiología fúngica osciló entre 2,0 y 3,8 infecciones por cada 1000 casos entre 1980 y 1990. Especies de Candida, entre los años 1985 y 1988, ocuparon el cuarto lugar de todas las infecciones nosocomiales, seguido por Staphylococcus ssp. coagulase negativo, Staphylococcus aureus, y Enterococcus sp. (1) Aparte de Candida spp., otras especies de patógenos fúngicos tales como Fusarium spp.; Trichosporon beiguelli, diversas especies de zigomicetes y otros hongos usualmente no patógenos, se han reconocido como causantes de importantes problemas en algunos pacientes.

A esto, debemos sumarle hongos patógenos oportunistas, tales como Histoplasma capsulatum, Coccidiodes immitis y Cryptococcus neoformans los cuales se encuentran, frecuentemente en pacientes inmunosuprimidos inducidos químicamente y en pacientes con SIDA.

Cryptococcus neoformans es un agente que causa infección en aproximadamente del 6% al 10% de individuos con SIDA en los Estados Unidos, y en más del 30% de pacientes con SIDA, en África. Por otra parte, cerca del 90% de pacientes con SIDA que han sido infectados por Cryptococcos neoformans desarrollan meningitis(2).

Paralelamente al incremento en la infecciones fúngicas, en la última década se han introducido nuevos agentes antifúngicos con actividad sistémica, de los cuales solo seis actualmente tienen licencia para ser usados en infecciones fúngicas sistémicas; sin embargo, se ha hecho extensivo el descubrimiento y la investigación en el desarrollo de otras drogas antifúngicas.
 

Agentes antifúngicos sistémicos

Polienos

La Anfotericina B (1956; E.R. Squibb & Sons, Princeton, NJ), en presentación liposomal y el complejo Anfotericina B y lípidos son los macrólidos de polieno usados primeramente en el tratamiento de infecciones sistémicas y en infecciones fúngicas de tratamiento largo. La formulación liposomal y el complejo de lípidos de Anfotericina B han sido sometidas a evaluación clínica. Los agentes antifúngicos de tipo polieno actúan mediante la unión con el ergosterol de la membrana de la célula füngica, causando inestabilidad osmótica y la pérdida de la integridad de la membrana. La toxicidad directa de la membrana es debida en parte al daño oxidativo lo cual es frecuentemente fungicida (3). El efecto se extiende a las células mamíferas, en las cuales la droga se une al colesterol, provocando la alta toxicidad asociada con los agentes de tipo polieno.

La Anfotericina B es producida por Streptomyces nodosus (4); y ha sido usada por muchos años en el tratamiento de enfermedades micóticas, es inestable cuando se expone al calor, luz o pH ácido. La resistencia a la Anfotericina B es rara, sin embargo se han correlacionado cambios en los esteroles de membrana con el desarrollo de resistencia tanto in vitro como in vivo (5). Las formulaciones liposomales y el complejo de lípidos de Anfotericina B, fueron disecadas para maximizar la distribución de la Anfotericina B en pacientes con infecciones fúngicas diseminadas tales como la candidiasis hepatoesplénica y la aspergilosis pulmonar invasiva, una de las ventajas que presentan este tipo de drogas es que poseen una toxicidad selectiva para las células fúngicas y no para los eritrocitos.
 

Azoles

Los azoles como antifúngicos fueron introducidos a finales de 1960, pero solamente un grupo de ellos ha demostrado actividad antifúngica sistémica, el miconazole, ketoconazole, fluconazole y el itraconazole; los azoles inhiben el citocromo P-450 dependiente de enzimas, lo que resulta en la síntesis incompleta del ergosterol y la degeneración del ergosterol de la membrana de la célula fúngica.

El Miconazole y el Ketoconazole fueron establecidos como agentes imidazoles de amplio espectro para una variedad de patógenos fúngicos, incluyendo levaduras, hongos dimórficos, dermatofitos y patógenos oportunistas.

El Miconazole (1970; Janssen Pharinaceutica, Piscataway, N:J.) fue el primer derivado de los azoles desarrollado para ser administrado intravenosamente en la terapia de infecciones fúngicas sistémicas.

No obstante su relativamente alta toxicidad, su uso es limitado para ciertos casos de pseudallecherosis, meningitis cryptococcal, y meningitis coccidiodal en niños y se administra intraventricularinente junto con ketoconzale oral.

El ketoconazole (1977; Janssen Pharinaceutica) es un agente antifúngico que se absorbe oralmente, para su absorción y su penetración dentro del fluido cerebroespinal requiere un pH intragástrico normal, este se estableció como una alternativa efectiva de la Amphotericina B para el tratamiento de individuos inmunocompetentes con histoplasmosis localizada o diseminada, blastomycosis, candidiasis mucocutánea y paracocddioidomicosis.

En los últimos años, el itraconazole y fluconazole, han sido aprobadas como agentes sistémicos orales activos con menor potencial de toxicidad que los imidazoles, por su mayor unión específica a los citocromos de la célula fángica que a los citocromos de la célula mamífera.

El fluconazole (Phizer Pharmaceuticals, New York, N.Y) es una molécula relativamente pequeña que es parcialmente soluble en agua, fácilmente absorbida y con una vida media prolongada (hasta 25 horas en humanos), se excreta como droga activa en orina y penetra dentro del fluido cerebroespinal.

El itraconazole (Janssen Pharmaceutica) es un componente lipofilico que se caracteriza por su buena absorción oral, distribución extensiva en los tejidos y una larga vida media en el suero. El itraconazole es muy insoluble en fluidos acuosos y tiene una alta tasa proteica (más del 90%). Esta droga se une fuertemente a las proteínas plasmáticas y penetra ligeramente dentro del fluido cerebroespinal y a la orina pero lo hace bien en la piel y en los tejidos.
 

Inhibidores de la síntesis de pirimidina

La 5-Fluorodtocina (5-FC) (Hoffmann- La Roche Inc., N.J.) es soluble en agua, es un compuesto estable, de uso oral en el tratamiento de infecciones sistémicas, causadas por levaduras oportunistas o patógenos y otros tipos de hongos.

Su modo de actuar es como un antimetabolito competitivo para uracilo en la síntesis del ARN de la levadura, y también interfiere con la timidilato sintetasa. Hay 5 enzimas involucradas en el modo de acción de la 5-FC. Al menos 2 sitios metabólicos son responsables de la resistencia hacia la 5-FC, uno involucro la enzima citosina permeasa y la otra la enzima citosina deaminasa, la primera está relacionada con la captura de la 5-FC dentro de la célula fúngica y la segunda con la conversión de la droga a la forma metabólicamente activa.

Pruebas de susceptibilidad a antifúngicos

Las pruebas de susceptibilidad in vitro son similares en diseño a las pruebas con agentes antibacterianos. Las pruebas de susceptibilidad in vitro idealmente:

a) Proporcionan una medida contable de la actividad relativa de dos o más agentes antifángicos.

b) Deben correlacionar la actividad in vivo y predecir qué se puede esperar en la terapia.

c) Permiten monitorear el desarrollo de la resistencia entre poblaciones de organismos normalmente susceptibles

d) Predicen el potencial terapéutico de agentes de reciente descubrimiento.

El Comité Nacional para los estándares del Laboratorio Clínico (NCCLS) ha propuesto como método de referencia el método de caldos de dilución para pruebas de susceptibilidad de hongos levaduriforrnes.

No es frecuente hacer pruebas de susceptibilidad con Anfotericina B, esto debido a los raros casos de resistencia a esta droga en especial para los aislamientos de Candida spp., los zigomicetes, y Pseudallescheria boydii. Los otros hongos son por lo general susceptibles a esta droga. Las pruebas de susceptibilidad de los azoles tiene algún valor en los aislamientos de levaduras, debido a que la susceptibilidad a estas drogas por parte de las levaduras es variable. No obstante, estas pruebas no se garantizan para hongos dimórficos, debido a que estos aislamientos son usualmente susceptibles a ellos. In vitro las pruebas de susceptibilidad con 5-FC son más importantes clínicamente que pruebas que utilizan compuestos de polienos o azoles porque se ha demostrado resistencia a la 5-FC como la emergencia de cepas de levaduras y otros hongos resistentes después de la exposición terapéutica a esta droga.

La mayoría de los hongos incluyendo los hongos dimórficos, son resistentes a la 5-FC. No obstante los resultados de estas pruebas deben ser interpretados con precaución, debido a que los resultados no son siempre un reflejo predictivo de las respuestas clínicas.

Las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos son influenciados por un número de variables técnicas, que incluyen, el tamaño del inóculo y la preparación del mismo, la formulación y el pH del medio, la duración y la temperatura de incubación, y el criterio usado para la determinación del punto final. Además, las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos son complicadas por problemas de los mismos hongos, tales como una tasa de crecimiento lenta (comparada con las bacterias) y la habilidad de ciertos hongos dimórficos para crecer como una levadura unicelular que produce blastoconidias, hifas o formas de hongos filamentosos que pueden producir esporas asexuales dependiendo del pH, la temperatura y la composición del medio.

Finalmente, las propiedades básicas de los agentes antifúngicos tales como la solubilidad, la estabilidad química, modos de acción y la tendencia a producir inhibición parcial del crecimiento en un amplio rango de concentraciones, son dignas de ser tomadas en cuenta.

La determinación del punto final o CMI, es un paso crítico en las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos, especialmente con los azoles. La inhibición parcial que es observada con el 5-FC y los azoles hace difícil la determinación de un buen punto final y crea mucha variabilidad.

Tradicionalmente, la CMI fue considerada como la más baja concentración de un agente antifúngico que inhibe totalmente el crecimiento de un hongo.

La determinación del Punto Final (CMI) con un criterio menos estricto (baja turbiedad cerca del punto final es ignorada), ha incrementado la reproducibilidad entre diferentes laboratorios y produjo un cambio en la distribución de la CMI hacia bajas concentraciones de droga para Candida albicans y Candida tropicalis especialmente cuando se utilizan los azoles.
 

Método estandarizado para hongos levaduriformes

La necesidad de desarrollar métodos estandarizados en las pruebas de susceptibilidad a antifúngicos fue con la idea de proveer buena concordancia entre los laboratorios y en una mayor y cuidadosa comunicación laboratorio-médico. La estandarización juega también un papel importante en la necesidad de evaluar las correlaciones de la eficacia de la droga in vivo versus in vitro. En respuesta a estas necesidades, en 1992 la NCCLS propuso como método dt referencia las pruebas por dilución y publicó su informe M27-P, donde se especifican las necesidades básicas para realizar en forma eficiente las pruebas de susceptibilidad para los diferentes agentes micóticos, y especialmente los agentes levaduriformes tales como Candida spp, Torulopsis glabrata y Cryptococcus neoformans.
 

Pruebas de macrodilución

El método de macrodilución es el más ampliamente usado y es el método de referencia para células levaduriformes y es el propuesto por la NCCLS.

Este método es adecuado para probar todos los agentes antifúngicos de cualquier aislamiento fúngico. Este método se utiliza en laboratorios en los cuales el volumen de estas pruebas sea bajo.

El medio de cultivo que se utiliza, se define como un medio sintético y actualmente, se está utilizando el caldo RPMI 1640 con L-glutamina y un indicador de pH sin bicarbonato de sodio.

Dicho medio, es bufferizado a pH 7,0 a 25°C. Un buffer que da resultados satisfactorios para pruebas antifúngicas es el MOPS el cual tiene una molaridad final de 0, 165 para un pH de 7,0.

Este medio es apropiado para Anfotericina B, 5-FC, y azoles y es el recomendado a emplear cuando se realiza una prueba de susceptibilidad contra especies de Candida y varios hongos filamentosos.

No obstante, el RPMI 1640, no es adecuado para soportar el crecimiento de algunas cepas de Cryptococcus neoformans y no permite distinguir aislamientos susceptible, de algunas cepas potencialmente resistentes a anfotericina B.
 

Diluciones de la droga

Las concentraciones de la droga son preparadas usando al menos 10 veces la concentración más alta a ser probada, por lo que la solución estándar de la droga, es preparada utilizando agua destilada y esterilizada por filtración, esto para el caso de la 5-FC, en el cual se prepara una solución estándar de una concentración de 1280 ug/ml. Para el caso de la anfotericina B u otros polienos, se pesa suficiente estándar de la droga para conseguir una concentración de 1600 ug/ml La cantidad para ser pesada puede ser ajustada de acuerdo a la actividad biológica específica.

Para la preparación del inóculo, se emplea un método espectrofotométrico y los organismos que serán sometidos a esta prueba de susceptibilidad, se ponen a crecer en placas con agar Saboureaud o agar Sabourcaud modificado y se incuban a 35'C y se subcultivan al menos 2 veces para asegurar pureza y viabilidad. La suspensión del inóculo se prepara picando cinco colonias, cada una de al menos 1 mm de diámetro y se utilizan cultivos de 24 horas en Candida ssp. y Torulopsis ssp.

Para Cryptococcus neoformans, se utilizan cultivos de 48 horas y se suspenden en 5 ml de NaCí al 0,85%. La turbiedad de la suspensión celular se mide a 530 nm se ajusta con solución salina para comparar la tramitancia producida por un estándar de sulfato de bario o estándar de McFarland al 0,5. Esto produce una suspensión celular que contiene de Ix 10⁶ a 5x10⁶ organismos por mililitro, los cuales en una dilución 1:2000 con medio RPMI proveerá un inóculo para la prueba de 0,5x10³ a 2,5x10³ organismos por mililitro.
 

Test de la microdilución

Las pruebas antifúngicas usando el método de microdilución es similar al de la prueba de la macrodilución, y provee resultados comparables. Estas pruebas por microdilución no se usan con frecuencia como las pruebas de macrodilución. Sin embargo un estudio reportado por la NCCLS ha demostrado discrepancias entre las dos pruebas; macro y microdilución. Sin embargo, las diferencias entre las dos pruebas no son estadísticamente significativas y es muy posible que la utilización de la microdilución sea más fácil y eficiente en un laboratorio clínico. Además de las pocas discrepancias entre las dos pruebas, se tiene en común acuerdo entre los diferentes laboratorios, que las pruebas de microdilución proveen una CMI más consistente.

Las diluciones de la droga 10x descritas para el método de la macrodilución, se diluyen 1:5 con RPMI para lograr la dilución 2x necesitada para la microdilución. Las suspensiones del inóculo para hongos levaduriformes se mezclan por 15 segundos en un vortex, se diluyen 1:50, y por último se diluyen 1:20 con medio de cultivo para obtener un inóculo 2x que corresponde a 1x10³ a 2,5x10³ UFC/ml).

El inóculo 2x se diluye 1:1, cuando los pozos en la placa se inoculan por lo que el tamaño final del inóculo es de 0,5x10³ a 2,5x10³ UFC/ml.

El test de microdilución está diseñado para ser usado con placas de 96 pozos, que deben ser estériles y con fondo plano o en U. Con una pipeta multicanal se dispensan volúmenes de 100 ul de la concentración 2x de la droga y se colocan desde el poso 1 al 10, empezando por la concentración más alta y así sucesivamente hasta la concentración más baja. El pozo del tubo control contiene 100ul de medio sin droga estéril y se inocula con 100 ul de suspensión diluida 2x de inóculo.

Las placas para microdilución se incuban a 35°C y se observan por la presencia de crecimiento visible. Los pozos para microdilución se observan con la ayuda de un espejo lector y el crecimiento de cada pozo es comparado con el crecimiento del pozo control negativo (sin droga). Para caracterizar cada pozo se utiliza un puntaje con un rango numérico que va en una escala de 0 a 4: 0 ópticamente claro o transparente; 1 ligeramente turbio; 2 prominente incremento en la turbiedad; 3 ligera reducción en la turbiedad; 4 no reducción en la turbiedad. La CMI para anfotericina B se define como la menor concentración de droga, en el cual el puntaje es 0 (ausencia completa de crecimiento), y para la 5-FC y los azoles se describe como la mínima concentración en la cual se observa un puntaje de 2 (4).
 

Métodos de macro-micro dilución para hongos filamentosos

El número de infecciones causada por hongos filamentosos es menor que el número de infecciones causada por levaduras y para estos hongos oportunistas es también muy importante las pruebas de susceptibilidad en el laboratorio clínico (4).

El problema para desarrollar y estandarizar pruebas para hongos levaduriformes ha sido considerable y tales pruebas para hongos filamentosos representa un gran cambio. Se espera que con la estandarización de los métodos de susceptibilidad para hongos levaduriformes, se haya abierto la puerta para desarrollar pruebas de susceptibilidad para hongos filamentosos.

En recientes estudios de Espinel-Ingroff et al (2,4), se evalúa una modificación del método espectrofotométrico usado en los inóculos de levaduras para la preparación de suspensiones de inóculos en hongos filainentosos. Las suspensiones de conidias se han preparado, y la turbiedad se ajustó con un espectrofotómetro de 68 a 82% a 530nin de acuerdo a las especies que se están probando. La densidad del inóculo de 1,4x10 UFC/ml, fueron obtenidas con el 90% de seis laboratorios participantes.

Al método de referencia para levaduras, se le modificaron ciertos pasos.

El inóculo para cada aislamiento se prepara con el primer crecimiento del hongo en agar papa dextrosa por 7 días a 35°C. Una suspensión se prepara poniendo las conidias a flotar en el recipiente con 2ml de solución salina estéril 0,85%. La mezcla resultante se retira y las partículas pesadas se dejan asentar de 3 a 5 minutos. La suspensión homogénea superior cont iene las conidias y se mezclan con un vortex por 15 segundos. La turbiedad de la suspensión se mide con un espectrofotómetro a 530 mn y se ajusta al rango de transmisión final específico para cada especie probada. Solo las suspensiones de conidias de 0,5x104 a 5x104 de hongos mohosos han sido evaluadas por pruebas de susceptibilidad a antibióticos por este método.

El organismo de control de calidad usado para pruebas en hongos levaduriformes más un aislamiento de Paecilomyces sp ATCC 22319, podrían ser usados de la misma manera con otros aislamientos y deben ser incluidos cada vez que un aislamiento se evalúa con algún agente antifúngico.

Todos los tubos de la macrodilución se incuban a 35°C y se observa cada día la presencia de crecimiento, cuando el crecimiento es visible en control de crecimiento, cada tubo se mezcla en vortex por 10s imnediatamente antes de ser evaluado, lo cual permite la detección de pequeños incrementos en el crecimiento. El crecimiento en cada tubo y posillo se compara con el crecimiento control (sin droga) y se otorga un puntaje numérico: 0, ópticamente claro o que no muestra crecimiento; 1 aproximadamente 75% reducción de crecimiento; 2, 50% en la reducción del crecimiento; 3,aproximadarnente un 25% en la reducción del crecimiento; 4 no reducción del crecimiento.

El criterio para el punto final o CMI para hongos mohosos (por ambos macro y micro dilución), es la más baja concentración de la droga que da un puntaje de crecimiento de 1 o la concentración de droga más baja que inhibe aproximadamente un 75% o más del crecimiento del hongo comparado con el crecimiento de un control de crecimiento.
 

Métodos de difusión en agar

Las pruebas de susceptibilidad antimicrobianas con métodos de difusión en agar son de uso común en los laboratorios clínicos. Alrededor del mundo la técnica más comúnmente empleada para pruebas de susceptibilidad a antibióticos es la prueba de difusión en disco, el cual provee resultados cuantitativos por medio de la lectura de zonas de inhibición y brinda también una categoría de interpretación cualitativa por ejemplo decir susceptible o resistente. Recientemente la técnica de E-test (AB Biodisk) se ha introducido como un medio para obtener una CMI más preciso y cuantitativamente reproducible usando una difusión en agar.

El E-test se basa en la difusión de una continua gradiente de concentración de un agente antimicrobiano proveniente de una tira plástica hacia un medio de agar. Esta nueva metodología se compara con las técnicas en caldo y agar de susceptibilidad a antibióticos y es superior a los métodos de discos. La flexibilidad del E-test lo hace aplicable a un amplio rango de pruebas de susceptibilidad a antibióticos incluyendo las pruebas antifúngicas.

La aplicación de los métodos de difusión en agar para probar agentes antifúngicos es limitada a la fecha , sin embargo este método tiene buena correlación con los métodos de referencia de la NCCLS. El E-test parece ser la más valiosa para probar organismos para los cuales no hay ningún método de rutina de pruebas cuantitativas y puede ser útil para probar agentes antimicrobianos, como los azoles que dan puntos finales dispersos con el método de caldos de dilución.

Para este método, se utilizan cepas de la ATCC como control de calidad (1).
 

Neosensitabs (Rosco Denmark)

Se utiliza una placa de Agar Shadomy, y se colocan los discos para los azoles. Este método se utiliza para hongos levaduriformes. Se hace una suspensión del inóculo que quede comparado al 0,50% con respecto al estándar de McFarland, se raya en todas direcciones la placa y se deja secar descubierta por 15 minutos a 37°C. Este medio Shadomy tiene en su composición cloranfenicol; al estar la placa seca se colocan los discos para los azoles, se incuba por 18 horas a 37°C y posteriormente a la incubación se lee los halos de inhibición y se clasifican por sensibles, intermedios y resistentes.
 

 ATB Fungus (Antibiograma para levaduras)

Las galerías ATB Fungus (biomérieux SA) permiten determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos en medio semi sólido (6).

Las galerías ATB Fungus incluyen 16 pares de cúpulas. Cuatro pares de cúpulas no tienen antifúngico y sirven de testigo de cultivo. Los otros pares contienen antifúngico en dos concentraciones (c y C) para categorizar las cepas. Dos antifángicos se encuentran presentes en varias concentraciones, lo que permite completar la respuesta mediante una CMI (5).

La levadura a analizar es puesta en suspensión, luego transferida al medio de cultivo e inoculada en la galería. Tras 24-48 horas de incubación, la lectura del crecimiento se hace en forma visual o con el sistema ATB o mini API. El resultado obtenido permite clasificar la cepa como sensible, intermedia o resistente, o suministrar una CMI (5-Fluorcitocina y Anfoteridna B).
 

Comentario Final

Las pruebas de susceptibilidad para agentes micóticos, son cada vez más necesarias de implementar para un laboratorio clínico que maneje pacientes inmunosupresos.

Las dificultades inherentes a estos métodos son apreciables, pero es una metodología que sin lugar a dudas, debemos implementar.

Son muchas las oportunidades, en las cuales se observa un fallo terapéutico y se requiere una confirmación de la sospecha clínica, de que hay resistencia a los antifúngicos.
 

Referencias Bibliográficas

1. Espinel-Ingroff A. & Pfaller M.: Antifungal Agents and susceptibility Testing. Manual of clinical microbiology, ed 6. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C. 1995.         [ Links ]

2. Espinel-Ingroff A., Kerkering T., Goldson P. & Shadomy S.: Comparison study of broth macrodilution and microdilution antifugal susceptibility. J. Clin. Microbiol. 29:1089, 1999.         [ Links ]

3. Espinel-Ingroff A. White T. & Pfaller M.A.: Antifungal Agents and Susceptibility Tests In: Manual of clinical microbiology, ed 7. American Society for Mierobiology Washington, D.C., 1999.         [ Links ]

4. Rex J., Pfaller M., Rinaldi G., et al.: Antifungal susceptibility testing. Clin. Microbiol. Rev. 6: 367, 1993.         [ Links ]

5. Sánchez M. & Jones R.: E test, an antimicrobial susceptibility testing method with broad clinical and epidemiologic application. Antimicrob. Newsl. 8:1, 1992.         [ Links ]

6. Quindes G., Salesa R. & Carrillo-Muñoz A.: Multicenter Evaluation of ATB Fungus: A Standardized Micromethod for Yeast Susceptibility Testing. Chemotherapy. 40: 245, 1994.         [ Links ]
 
 

* Laboratorio Nacional de Aguas Instituto Costarricense de Acueductos y Alcantarillados
jomendez@aya.go.cr

** División de Microbiología, Laboratorio Clínico Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" Caja Costarricense de Seguro Social, San José, Costa Rica mherrera@hnn.sa.cr