Aislamientos de Enterococcus spp., resistentes a la vancomicina, en muestras de heces de niños costarricenses     Dr. Marco Luis Herrera*, Dr. Alvaro Vargas* y Dra. Marlen Campos*    

Introducción

Hasta antes del año 1970 (5), dentro del género Streptococcus se encontraban algunos organismos que tenían características que los diferenciaban del resto de especies de este grupo.

Ejemplos de especies con estas características, tenemos al Streptococcus faecalis y al streptococcus faecium. Las diferencias que presentaban se encontraban principalmente en el agrupamiento celular, en varias características fenotípicas y principalmente en su patrón de sensibilidad, el cual difería completamente, del observado para el resto del género (4).

Sin embargo, no fue hasta el año de 1984, cuando Schleifer y Kilpper-Balz (20), usando estudios genéticos, propusieron la creación de un nuevo género donde se pudieran agrupar estos agentes y de esta manera se crea el género Enterococcus.

Hasta el momento, 17 especies están constituídas en este grupo de microorganismos (3).

Los Enterococcus son cocos Gram positivo, encontrados solos, en pares o formando cadenas y eventualmente pueden tener una morfología cocobacilar.

Son anaerobios facultativos y tienen un rango óptimo de crecimiento entre 30 y 35° C. Todas las especies crecen en caldos con 6,5% de NaCl e hidrolizan la esculina en la presencia de sales biliares. Son organismos catalasa negativa, pero en algunas oportunidades pueden ser catalasa positivo y el ácido láctico es el producto final de la fermentación de la glucosa (3).

Muchos de estos agentes pueden producir el antígeno D, usado en la clasificación de los Streptococcus sp. b -hemolíticos (3). El rango del contenido de Guanina más Citosina para este grupo es de 37 a 45 mol % (3).

En términos generales los Enterococcus sp. son cocos Gram positivo, catalasa negativo, anaerobios facultativos, no producen gas a partir de la fermentación de la glucosa, son pirolidonil b -naftilamida positivos, leucemia amino peptidasa positivos, bilis esculina positivos, crecen en caldos con NaCl al 6,5% y pueden ser alfa, beta o gamma hemolíticos (3).

Cada vez se hace más necesaria una confirmación fidedigna y una mejor clasificación de los componentes de este género, para lo cual se pueden utilizar los sistemas automatizados para la identificación bacteriana como el Sistema Vitek de la caso BioMerieux o el Sistema MicroScan de la casa Dade. Además pueden usarse sondas genéticas (accuProbe Enterococcus Test), proveídos por la casa Gen Probe Inc. En San Diego California (3).

Los Enterococcus sp., se distinguen por su capacidad de sobrevivir en el medio ambiente, por lo que pueden ser encontrados en el suelo, los alimentos, agua, animales domésticos, aves e insectos. Además se les puede encontrar formando parte de la flora normal intestinal y del tracto genito urinario de los seres humanos (3).

Como causa de patología, los enterococos han sido implicados en una gran variedad de cuadros clínicos, pero en especial, ellos están relacionados con infecciones nosocomiales, principalmente aquellas que se relacionan con el tracto urinario (14,16). Otros tipos de infecciones, en las cuales los enterococos son importantes son las infecciones intra abdominales y pélvicas (19), las bacteremias y septicemias (9).

Al Enterococcus faecalis, se le atribuye ser el agente causal de entre un 5 a 20% de todos los casos de endocarditis bacteriana (12).

En general, podemos concluir, que los Enterococcus sp., son organismos ampliamente distribuidos en la naturaleza, que es un importante patógeno productor de infecciones principalmente intra hospitalarias, donde se le aísla de infecciones urinarias, septicemias, endocarditis, infecciones abdominales pos cirugías e infecciones de heridas (9, 12, 14, 16, 19).

Los enterococos crecen bien en los medios de cultivo tradicionales, donde el agar sangre con sangre al 5% y una base de tripticasa soya puede ser un buen medio para el aislamiento primario (4). Crecen mejor en una atmósfera enriquecida con CO₂, pero esto no es un requisito indispensable para su aislamiento (3,4).

Intrísecamente los enterococos son resistentes a muchos antibióticos, como por ejemplo, la penicilina.

Este fue uno de los hechos más relevantes al crear el nuevo género y sacar, grupos de bacteria resistentes a los antibióticos de un grupo que comprende bacterias con amplia sensibilidad a los diferentes antibióticos. Al ser resistentes a los antibióticos tradicionales, se hace necesario el uso de antibióticos con mayor efecto como es el caso de la vancomicia, sin embargo, muchas especies del género Enterococcus tienen resistencia intrínseca a este antibiótico, como es el caso de Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus y Enterococcus flavescens (1,18).

Todo esto hace que las infecciones por enterococos sean difíciles de tratar y que generalmente necesiten del uso de antibióticos sinérgicos como es el caso de la vancomicina y un aminoglucósido (amikacina o gentamicina).

A partir del año de 1968, emergieron, en el ámbito mundial cepas de Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y Enterococcus avium resistentes a la vancomicina (23). Dichos reportes se iniciaron en los países europeos y en 1989, se detectó el primer aislamiento de este tipo en los EE.UU (2,3,14,16).

En América Latina, el primer reporte se dio hasta el año de 1998 y fue reportado por Marín et al. en Argentina (10).

Este hecho, nos presenta un panorama aún más complicado, donde las opciones terapéuticas para un paciente infectado con un enterococo resistente a la vancomicina, se ven muy reducidas, con un consiguiente aumento en la mortalidad de este tipo de pacientes (14,16).

La vancomicina es un antibiótico bactericida, obtenido de la fermentación del Streptomyces orientalis e inhibe la síntesis del peptodoglican de la pared celular bacteriana al formar un complejo con la porción D-alanil-D-alanina de los precursores de la pared celular (17). Es muy activo contra las cepas de Streptococcus sp., Corynebacterium jeikeum, Bacillus sp., Clostridium difficile, Flavobacterium meningosepticum y funciona como un agente bacteriostático al actuar contra las cepas de Enterococcus sp. (24).

La vancomicina no es activa contra los organismos Gram negativo, las mycobacterias y los hongos y las cepas de Leuconostoc sp. y Pediococcus sp., también tienen resistencia intríseca (24).

Como se dijo anteriormente, desde el año 1985, se han realizado reportes de aislamientos clínicos de Enterococcus faecalis (13), Enterococcus faecium (8), Enterococcus gallinarum (7) y Staphylococcus sp. coagulasa negativo (21), resistentes a la vancomicina.

Las bacterias Gram negativo son resistentes a la vancomicina, porque ésta no puede atravesar la membrana externa y no lo hace por su alto peso molecular, la rigidez de su estructura molecular y su alta hidrofobicidad (24).

Para los organismos Gram positivo, se han escrito varias formas o maneras de crear resistencia a la vancomicina. Uno de ellos es el desarrollo de un fenotipo VanA que confiere resistencia conjunta a la vancomicina y a la teicoplamina con concentraciones mínimas inhibitorias (MICs) mayores o iguales a 64 ug de droga activa. Un segundo mecanismo es el desarrollo de otro fenotipo VanB, que confiere una pobre resistencia al antibiótico , con MICs que van desde 16 a 512 ug de droga activa. Otro es el fenotipo VanC el cual es constitutivo y de poca importancia clínica, se presenta asociado a Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus y dichas cepas presentan MICs entre 2 y 32 ug de droga activa (6,22).

Dentro de los efectos adversos a la vancomicina que pueden presentar las personas tratadas con este medicamento están la fiebre, los escalofríos y la flebitis en el sitio de la infusión. En un 5% de los pacientes tratados, se puede presentar un cuadro de hipersensibilidad conocido como el Síndrome del Hombre Rojo, así como se puede inducir ototoxicidad, nefrotoxicidad y hepatotoxicidad (6,24).

Dada la importancia de la posible aparición de cepas de Enterococcus sp. vancomicina resistentes y existiendo en el laboratorio clínico de Hospital Nacional de Niños una vigilancia epidemiológica del patrón semestral de las bacterias aisladas, surgió, sobre la base de la revisión de estos datos, la idea de realizar una búsqueda sistemática de niños portadores de cepas de Enterococcus sp. intermedios o resistentes a la vancomicina.
 
 
Material y Métodos

En mayo de 1997, se inició la recolección de las muestras de heces.

Inicialmente se estudiaron niños ingresados a la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) y se buscaron pacientes que hubieran recibido antibióticos.

Se inició con la UCI, porque los niños ingresados allí, reciben altas dosis de antibióticos, dada la gravedad de su condición clínica.

Durante un periodo de 8 meses, se estudiaron 110 niños, cuatro en mayo, 9 en setiembre, 41 en octubre, 32 en noviembre y 28 en diciembre.

Las muestras de heces se obtuvieron por hisopado rectal y se les recolectaron a los pacientes con, al menos, 2 días de permanencia en la UCI.

Las muestras de heces, recolectadas, fueron llevadas al Laboratorio y una vez allí, se inocularon en dos tipos diferentes de medio de cultivo.

El primero de ellos fue un agar sangre al 7%, con sangre de banco de sangre y una base de Mueller Hinton. El segundo medio de cultivo empleado fue el mismo, pero se le adicionó vancomicina (Fujisawa USA Inc) a una concentración de 6 ug por mililitro de medio de cultivo (22).

Ambos medios de cultivo, se incubaron por 48 horas a 35° C en una atmósfera rica en CO2 y con revisión a las 24 horas.

Aquellas colonias no hemolíticas o alfa hemolíticas, que fueran cocos Gram positivo y catalasa negativa, se rayaron sobre una agar sangre fresco y se incubaron por un periodo de 16 a 18 horas.

Pasado este período de incubación, se montó una identificación y una prueba de sensibilidad, para la cual se utilizó el sistema automatizado Vitek de la casa BioMerieux, utilizándose para este efecto, tarjetas GPI para la identificación y tarjetas TA para la prueba de sensibilidad. En todo momento se empleó el protocolo recomendado por la casa BioMerieux.

Los estándares internacionales para la técnica de Bauer y Kirby, dicen que una cepa de Enterococcus sp., con un halo de inhibición menor o igual a 14 mm debe ser considerada resistente, intermedia si su halo está entre 15 y 16 mm y sensible si éste es mayor de 17 mm, todo esto para un disco normal con 30 ug de droga activa. Para la Mínima Concentración Inhibitoria (MIC), los datos aceptados son los siguientes: sensible: menor o igual a 4 ug, intermedio: 8 a 16 ug y resistente si la cepa presenta una Mic mayor o igual a 32 ug de droga activa (22).

Luego, durante los meses de abril y mayo del año de 1998, se realizó un tamizaje diferente.

En este segundo tamizaje, se estudiaron las muestras de heces de 190 niños, todos menores de 2 meses, que no estuviesen recibiendo antibióticos y con una estancia hospitalaria menor a las 12 horas al momento de la recolección de la muestra.

En el laboratorio, se emplearon los mismos tipos de medios de cultivo, la misma técnica de aislamiento e identificación y se siguieron los mismos parámetros para la interpretación de los resultados obtenidos.
 
 
Resultados

En la primera parte del estudio, se estudiaron 110 pacientes y de ellos se aislaron 18 cepas de Enterococcus sp. , para un 15,4% de aislamiento, de los cuales 2 fueron intermedios (MIC entre 8 y 16 ug), 2 fueron resistentes (MIC mayor de 32 ug) y 14 sensible con MICs menores o iguales a 2 ug de vancomicina.

La distribución de las cepas aisladas fue Ia siguiente: Enterococcus faecalis 9 cepas, Enterococcus faecium 4 cepas, Enterococcus avium 2 cepas, Enterococcus gallinarum, Streptococcus bovis, Sterptococcus sanguineus una cepa cada uno. Las cepas resistentes corresponden a una cepas de Enterococcus faecalis y otra de Enterococcus faecium (ver Cuadro1).

    Cuadro 1 Concentración Mínima Inhibitoria Enterococcus sp. y Streptococcus sp. aislados de niños recibiendo terapia antimicrobiana HNN, 1997  

MIC	E. faecalis	E. faecium	E. avium	E. gallinarum	Streptococcus sp.
Menor de 0,5 ug   2,0 a 4,0 mg   8,0 ug a 16 ug   Mayor de 32 ug   Total	6 2 - 1 9	2 1 - 1 4	2 - - - 2	- - 1 - 1	2 - - - 2

 
 
Los aislamientos se presentaron de la siguiente manera: 3 en setiembre, 2 en octubre, 8 en noviembre y 5 en diciembre para un porcentaje de aislamiento de 33,3; 4,9; 28,6 y 17,7% respectivamente.

La edad de los niños estudiados, en esta primera parte del estudio es muy variada, así como su procedencia, donde no se pudo establecer alguna relación epidemiológica entre ellos.

La edad de los 18 niños con aislamientos positivos por Enterococcus sp. o Streptococcus sp. se muestra en el Cuadro 2.

     Cuadro 2 Edad de niños recibiendo antibióticos con cultivo de heces positivo Según especie de organismo aislado HNN, 1997  

Edad	Total de pacientes	E. faecalis	E. faecium	E.  avium	E. gallinarum	Streptococcus sp.
Menor de 12 meses   12 meses a 2 años   2 años a 4 años   4 años a 8 años   Mayor de 8 años   Total	8 6 1 1 2 18	6 2 - - 1 9	1 3 - - - 4	- 1 1 - - 2	1 - - - - 1	- - 1 1 - 2

 

En la segunda parte del estudio se estudiaron 190 pacientes, 94 en abril y 96 en mayo de 1998.

Se aislaron 7 cepas de Enterococcus sp., sensibles a la vancomicina, 7 cepas intermedias y 2 resistentes para un 3,7; 3,7 y 1,05% para un total de 16 cepas.

De las cepas sensibles, 5 corresponden a Enterococcus faecalis y 2 son Enterococcus avium y presentan MICs menores a 4 ug.

De las cepas intermedias, 2 corresponden a Enterococcus faecalis, 4 a Enterococcus gallinarum y se aisló Enterococcus casseliflavus en un caso. Las cepas resistentes resultaron ser Enterococcus faecalis y Enterococcus avium cada uno con un aislamiento (ver Cuadro 3).
 

Cuadro 3 Concentración Mínima Inhibitoria Enterococcus sp. aislados de heces de niños sin tratamiento y que vienen de la comunidad HNN, abril a mayo de 1998  

MIC	E. faecalis	E. avium	E. gallinarium	E. casseliflavus
Menos de 0,5 ug   2,0 a 4,0 ug   8,0 a 16,0 ug   Mayor de 32 ug   Total	3 2 2 1 8	- 2 - 1 3	- - 4 - 4	- - 1 - 1

 
 
En este grupo de estudio, tampoco se encontró una relación con la procedencia de los niños y el hallazgo de cepas intermedias o resistentes a la vancomicina y es importante recordar que todos eran menores de 2 meses.    
Conclusiones

El presente estudio, es el primero realizado en Costa Rica y posiblemente en Centro América, donde se demuestre la presencia de cepas de especies del género Enterococcus con resistencia a la vancomicina.

Esta investigación está dividida en dos estudios. En el primero de ellos, se emplean heces de niños internados en una unidad de cuidado intensivo, con una muy variada edad y que reciben diferentes tipos de antibióticos. En la segunda parte, se estudian niños de poca edad, provenientes de la comunidad, que no reciben antibióticos en el hospital y con muy poca estancia hospitalaria.

Estos últimos pacientes, fueron escogidos, porque no han tenido una historia previa de terapias antimicrobianas y menos por tiempos prolongados.

En ambos grupos, los niños reclutados provienen de lugares muy diversos de la topografía nacional y no fue posible encontrar una relación epidemiológica entre ellos. En especial, los niños portadores de cepas de Enterococcus sp. resistentes o intermedios a la vancomicina, no presentaron ningún aspecto epidemiológico que pudiese relacionarlos y son niños que provienen tanto de áreas rurales como citadinas. Así como la procedencia, ni la edad ni el sexo fue un factor importante entre ellos.

La emergencia de cepas de Enterococcus sp. resistentes a la vancomicina viene de unos 10 años atrás y se inició principalmente en los países europeos. Los científicos europeos, han tratado de encontrar una explicación a este fenómeno, pero sin resultados concluyentes. Ellos atribuyen esta emergencia al uso indiscriminado de antibióticos en la alimentación animal, sin embargo aun hay muchos interrogantes al respecto (11).

En este estudio, no hemos logrado explicar el origen, en nuestro entorno, de estas cepas.

Lo importante es que están y que es necesario tomar medidas que nos permitan controlar este problema.

Posiblemente, la medida más importante es racionalizar el uso de vancomicina; a todo nivel.

Además, es importante resaltar que, con excepción de las cepas que poseen resistencia intrínseca, el desarrollo de esta resistencia es mediada genéticamente y que esta resistencia puede ser donada. Así pues, los fenotipos VanA, VanB y VanC podrían, por recombinación bacteriana, ser encontrados en cepas de Staphylococcus aureus o Staphylococcus sp. coagulasa negativo, lo cual sería de gran perjuicio para la salud de los costarricenses y produciría un aumento en los costos hospitalarios.

Otro aspecto importante de destacar es la identificación de cepas como Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus, los cuales son ampliamente reconocidos como portadores de fenotipos como el VanC, los que les confiere resistencia intrínseca, resistencia que fue determinada y claramente definida por nuestro sistema automatizado aún cuando esta resistencia es de bajo nivel.

El incremento en el uso de la vancomicina se ha presentado en todo el mundo y nuestro país no es la excepción. Las principales razones para este incremento están en el aumento en la incidencia de Staphylococcus meticilina resistente, el gran auge en las infecciones derivadas de la presencia de catéteres, la incidencia de infecciones por Clostridium difficile y el uso inapropiado de esta droga (11).

Como recomendaciones para impedir la diseminación de los Enterococcus vancomicina resistentes a escala hospitalaria, se mencionan varias cosas, entre ellas está la promoción del lavado de manos y la reducción drástica del uso de los glicopéptidos (11).

Las opciones de tratamiento para infecciones por Enterococcus resistentes a la vancomicina son escasas y la gran mayoría de las personas tratadas en estos casos, han recibido tratamientos empíricos. Se ha utilizado la ampicilina, el sinergismo con la gentamicina y el uso de nitrofurantoína para infecciones urinarias (15).
 
 
Resumen

Se hace referencia a la creación del género Enterococcus y sus especies importantes en patología humana así como su comportamiento ante la vancomicina y otros antimicrobianos.

Se presentan los datos de las especies de Enterococcus encontradas en los estudios realizados en material fecal de niños internados en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera" de Costa Rica.
 
 
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*División de Microbiología, Laboratorio Clínico, Hospital Nacional de Niños Dr. Carlos Sáenz Herrera, C.C.S.S. San José, Costa Rica.