Utilidad de la prueba de antigenemia cuantitativa (en leucocitos) en el diagnóstico de infección activa por citomegalovirus     Dr. Wilbert Alfaro*    
 
Introducción
 
El citomegalovirus (HHV-4) es un virus perteneciente a la familia Herpetoviridae, subfamilia Betaherpesvirinae, presenta simetría icosahédrica con 162 capsómeros y envoltura lipídica. Su ADN es de doble banda, de 235 Kb y codifica aproximadamente 200 proteínas (16).

La viremia por CMV es un marcador de infección diseminada, la cual es de difícil diagnóstico clínico.

Los métodos de detección de la viremia incluyen el aislamiento viral, la detección de ácido nucleico y la determinación de antígenos. Por ser los leucocitos los mejores portadores del virus (32), la detección rápida de antígenos tempranos del CMV por técnicas inmunológicas en éstos, es un indicador de infección activa (6,34).
 
 
Epidemiología

El CMV es uno de los parásitos humanos más exitosos (17); la incidencia en la mayoría de poblaciones en países subdesarrollados es mayor del 90%; puede transmitirse en la población vía vertical u horizontal, y durante las infecciones primarias, reinfecciones y/o reactivaciones, estas últimas producidas por su capacidad de permanecer latente en leucocitos y en algunas células epiteliales (18,25,32).

En cuanto a los mecanismos más comunes de transmisión (18), cabe citar: vía intrauterina, perinatal, postnatal, post transfusión sanguínea y post transplante (1, 7). Dada la terapia inmunosupresora, la reactivación del CMV en transplantados es casi siempre un hecho (4,29,30). En transplante de órganos sólidos en seropositivos, se detecta con mayor frecuencia la reactivación del CMV en el órgano donado, mientras que en transplante de médula ósea (TMO), se detecta con mayor frecuencia la reactivación del CMV del receptor (19, 16, 39).

El CMV se ha asociado como agente causal de rechazos de órganos transplantados y de enfermedad de rechazo injerto contra huésped en TMO (16, 24, 27, 36).

En los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana, el CMV es la infección viral oportunista más frecuente, se presentan casos severos de pneumonitis, coriorretinitis e infección diseminada (12, 31). Se ha demostrado un alto porcentaje de transmisión por contacto sexual entre hombres homosexuales (16, 18).

Del 20 al 60% de los receptores de transplantes y del 25 al 90% de los pacientes con sida, pueden desarrollar infección activa por CMV (24).
 
  
Reinfección, reactivaciones y recurrencia.

Reinfección: implica que el paciente se infecta de nuevo con una cepa diferente a la de la infección primaria.

Reactivación: el virus que se encuentra en estado latente y sin aplicarse (no se detecta ARm viral), inicia un nuevo ciclo de replicación, con producción de virus, aunque no necesariamente con sintomatología.

Persistencia: el virus se replica constantemente aunque en baja tasa, siempre se puede detectar ARm viral, se ha determinado este estado de persistencia principalmente en pacientes con sida.

En cuanto a las reactivaciones, pueden darse en seropositivos, inclusive hasta de dos cepas latentes diferentes. Se ha observado que el proceso, es edad dependiente, así que la probabilidad de reactivaciones baja casi a cero después de los 30 años de edad (16).

Estudios genéticos han demostrado reinfección aún con la misma cepa de la infección primaria, lo que corrobora que la seropositividad no implica protección.

Clínicamente es imposible diferenciar una infección primaria, de una reinfección o de una reactivación. Los cuadros clínicos más importantes, se especifican en el Cuadro 1.

    Cuadro 1 Cuadros clínicos más frecuentemente asociados a CMV  

a- Mononucleosis infecciosa (niños, adultos, jóvenes)

b- Enfermedad citomegálica (infección intrauterina)

c- Pneumonitis (infección perinatal)

d- Corioretinitis (sida)

e- Síndrome post-transfusión (neonatos)

 

El diagnóstico de laboratorio del CMV puede realizarse por varias técnicas (8, 16, 32, 36) entre ellas:

1. Aislamiento en cultivo celular a partir de muestras de orina, saliva o leucocitos; el mayor inconveniente de esta técnica es el tiempo requerido, que puede llegar inclusive de 22 a 56 días. Este método puede realizarse en nuetro país, en laboratorios especializados.

2. Diagnóstico histológico: observando las inclusiones de "ojo de pájaro" en cortes de tejido, patognomónicas de infección citomegálica. Es un método muy específico, pero poco sensible.

3. Observación del agente por microscopía electrónica o inmunomicroscopía: no es una técnica que se puede utilizar de rutina en hospitales nacionales, además morfológicamente los herpetoviridae son similares.

4. Hibridación o Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR): sirve para identificar el ADN o el ARNm viral (37). Aunque es la técnica más utilizada en países desarrollados, todavía en los hospitales nacionales no contamos con esta tecnología; además, la interpretación de demostración de ADN de virus que producen infecciones latentes es conflictiva (13, 33).

5. Determinación de antígenos virales por inmunofluorescencia (IFA) o ELISA de captura, en biopsia fluídos o leucocitos (antigenemia).

6.Diagnóstico serológico: es quizás la técnica que presenta mayores problemas de interpretación (23), por los siguiente aspectos:
 

6.1 Una IgG positiva sólo tiene interés epidemiológico, ya que persiste de por vida
luego de la infección primaria.

6.2 La IgM persiste por 3 o 4 meses post-infección primaria, pero no se eleva en
reactivaciones en personas inmunocompetentes (16).

6.3 Las personas inmunodeficientes pueden dar falsos negativos por IgG, ya que presentan títulos muy     bajos.  Contrario a lo observado en inmunocompetentes los inmunosuprimidos no elevan IgM en la         primoinfección, pero sí luego de reactivaciones; probablemente su sistema inmune necesite de un estímulo mayor     (16).

6.4 Puede darse transferencia pasiva de IgG en transfusiones.

6.5 La seropositividad no implica protección ni de una reinfección ni de una reactivación.

6.6 Es prácticamente imposible distinguir serológicamente una reinfección de una reactivación.

La técnica de determinación de antígenos virales por inmunofluorescencia en leucocitos (antigenemia), es una técnica propuesta por van der Bij y colaboradores a finales de los años 80 (37); permite detectar antígenos tempranos virales en leucocitos, principalmente la pp65 (14, 22, 33).

Es una técnica con un 90% de sensibilidad y un 96% de especificidad, que correlaciona muy bien con las manifestaciones clínicas y con el pronóstico del paciente (4, 37).

Se han realizado varios estudios comparando la técnica de antigenemia, con las técnicas de "shell vial", PCR e hibridación, y han demostrado que existe muy buena correlación entre antigenemia y enfermedad activa por CMV, demostrada por cultivo o determinación directa del ADN viral (9, 11, 13, 26, 33, 35).

Quizás su mayor ventaja sea el tiempo necesario para obtener los resultados: de 4 a 6 horas.

La técnica cuantitativa en polimorfonucleares, se puede utilizar para monitorear pacientes antes, durante y después del tratamiento con ganciclovir o foscamet (15, 22, 27, 36).

El diagnóstico por antigenemia es ideal para detectar citomegalovirus activo en receptores de transplantes y en individuos con infección o enfermedad por VIH (5,19).

En pacientes post-transplante de órganos sólidos se recomienda cada 2 semanas los primeros 3 meses y mensualmente por 6 a 12 meses (33).

En pacientes sidóticos o bien post-transplante de médula ósea, se recomienda una vez por semana cuando se sospeche clínicamente la infección (fiebre por 3 días o más, artralgia, leucopenia, trombocitopenia, aumento de enzimas hepáticas o pneumonitis inexplicable) (22, 27).

La muestra requerida para el análisis, debe ser de 6 a 10 ml de sangre total heparinizada, y es necesario que el procedimiento de la muestra se lleve a cabo dentro de las 2 primeras horas post-recolección, el 80% de la tasa de detección puede disminuir si la muestra se procesa después de 6 horas de la recolección (5, 28).

En cuanto a la técnica en sí, se puede realizar tanto cuantitativa en polimorfonucleares separados con Dextran PM 70000 (21) o bien cualitativa en linfocitos separados con Ficoll-Hipaque (38).

La determinación de antígenos se puede llevar a cabo por inmunofluorescencia (IFA) o inmunoperoxidasa (IPA), si se usa la inmunoperoxidasa en leucocitos totales, hay que eliminar la actividad peroxidasa endógena producidas por los eosinófilos, con un pretratamiento con metanol-H₂O₂ (14). Sin embargo, se obtienen mejores resultados con la IFA. Se puede utilizar además el sistema avidina-biotina o fosfatasa alcalina para el marcaje.

La interpretación se basa en el conteo del número de leucocitos positivos por 200.000 leucocitos estudiados (20):

a) Negativo: 0 (cero) leucocitos positivos.
b) Positivo débil: de 1 a 10 leucocitos positivos
c) Positivo: de 10 a 49 leucocitos positivos
d) Altamente positivo: 50 o más leucocitos positivos.

Los resultados positivos débiles pueden esperarse durante etapas tempranas de las reactivaciones o durante el tratamiento antiviral (2, 5). Un aumento en la antigenemia implica infección activa; una disminución correlaciona muy bien con eficacia del tratamiento y por el contrario, antigenemia altamente positivas aún después de tratamiento indican resistencia a éste (24).

En el Hospital Nacional de Niños, hemos estado utilizando la técnica de antigenemia para el diagnóstico de infección aguda por CMV; hasta el momento hemos procesado 70 muestras, de las cuales 12 (17%) se reportaron altamente positivo, 13 (19%) como positivo, 7 (10%) positivo débil y 38 (54%) negativo.

En nuestro Hospital utilizamos la prueba de antigenemia únicamente en pacientes seropositivos por VIH, pacientes post transplante, principalmente de médula ósea y en pacientes cuya sintomatología sugiera al médico una posible infección aguda por CMV.

De los resultados obtenidos, todos los casos reportados como altamente positivo, corresponden a pacientes seropositivos por VIH, con reactivaciones del CMV. Dentro de los reportados positivo, la mayoría de casos (75%), corresponden a pacientes post transplante de médula ósea con reactivación viral y el 25% restante a infecciones primarias por CMV, diagnosticados como tales por ser IgG e IgM anti-CMV negativas.

Los casos débil positivo, no mostraron ningún patrón epidemiológico en especial, pero al 50% de estos pacientes, cuando se les repetía el examen una semana después, estaban positivos o altamente positivos, lo que indica que los resultados obtenidos en la primera muestra, se debían probablemente a etapas tempranas de infección.

Los resultados negativos se asociaron con no infección por CMV, no reactivación del virus o tratamientos exitosos con ganciclovir. Es importante anotar que en aquellos casos altamente positivos, tratados con ganciclovir, a partir del día 2 del tratamiento, el conteo del número de células positivas decae drásticamente hasta llegar a negativizarse.
 
 
Conclusiones

La técnica de antigenemia cuantitativa para el diagnóstico de infección activa por CMV, es altamente sensible y específica, puede darnos un estimado de la carga viral y puede utilizarse para monitoreo del tratamiento antiviral.

En pacientes con sida o transplantados, es una prueba ideal para el diagnóstico de reactivaciones del CMV, incluso antes de la aparición de síntomas, lo que permite instaurar la terapia antes de la reactivación clínica.

Ya que está demostrado que la serología no la podemos utilizar para el diagnóstico de reactivaciones o reinfecciones del citomegalovirus, la antigenemia es la prueba diagnóstica de elección en estos casos; además, correlaciona muy bien otras técnicas moleculares por PCR e hibridación y tiene la ventaja de no requerir equipo tan valioso y sofisticado, por lo que es posible realizarla en nuestros hospitales.
 
 
Resumen

Se discute en este trabajo la importancia de la prueba de antigenemia para el diagnóstico de infección activa por citomegalovirus (CMV).

Se presenta una revisión de los principales aspectos involucrados en la transmisión del virus, así como ventajas y desventajas de la mayoría de técnicas utilizadas en el diagnóstico del CMV, especificando las ventajas que presenta la antigenemia en cuanto a especificidad, sensibilidad, tiempo y correlación con la clínica del paciente; además, la utilidad de la prueba en el monitoreo de la terapia antiviral.
 
 
Abstract

The importance of antigenemia assay for the diagnostic of active infection of cytomegalovirus (CMV) is discussed.

A review of the main aspects related to virus transmission and the advantages and drawbacks of most common diagnostic test used for CMV, is also presented.

The improvements that represent the antigenemia test acording to specificity, sensibility plus time and correlation to clinical patient features is analyzed, as well as the usefulness of this antiviral therapy follow-up.
  
 
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* División Inmunología-Laboratorio Clínico. Hospital Nacional de Niños "Dr. Carlos Sáenz Herrera". Caja Costarricense de Seguro Social, San José, Costa Rica.