Introducción

La raicilla (Psychotria ipecacuanha) es una especie vegetal con amplias y reconocidas propiedades medicinales (¹). Esta especie, perteneciente a las Rubiáceas, es un cultivo perenne de entre 0,2 y 0,7 m de altura el cual se ha venido desarrollando con cierto éxito en zonas de alta humedad, bajo condiciones de sombra artificial o de áreas de cultivo en sotobosque (²). No obstante, problemas de sobreexplotación de las poblaciones naturales existentes; así como dificultades en los procesos de propagación de semilla dificultan la obtención de materiales para solventar las necesidades de productores interesados en este cultivo (³). Esto ha generado que el cultivo de tejidos se convierta en una alternativa para la multiplicación rápida de materiales con el fin de solventar las necesidades de materiales para su reproducción vegetativa (¹, ⁴). Los primeros trabajos sobre la micropropagación de P. ipecacuanha fueron reportados por Yoshimatsu y Shimomura (⁵). A nivel in vitro, la raicilla puede propagarse mediante organogénesis directa (⁶) y embriogénesis somática (¹, ⁶). El método de propagación in vitromás utilizado es la microestaca; sin embargo, regeneración de explantes de hojas, segmentos internodales y raíces han sido reportadas (⁷, ⁸). Por lo general, el medio de cultivo más utilizado es el Murashige y Skoog (MS) (⁹), suplementado con sacarosa al 2 - 3% y pH entre 5,7 y 5,8. Si bien diversas combinaciones de reguladores de crecimiento se han evaluado en dicho cultivo (¹, ⁵, ⁷), la regeneración de brotes se ha reportado sin la necesidad de la adición de los mismos mediante síntesis endógena de auxinas y citoquininas (⁸).A pesar de las grandes expectativas que se han generado con la micropropagación del cultivo, lo cierto es que esta tecnología no ha tenido el impacto esperado debido a la poca utilización que se le ha dado relacionado a los elevados costos de producción de dichos materiales (¹⁰). Según Daud y colaboradores (¹¹), los costos de producción del medio de cultivo tienen un fuerte impacto en el costo final de las plantas producidas; por lo que la sustitución de insumos para abaratar los costos de preparación del medio de cultivo podría generar una mayor accesibilidad de estas tecnologías al sector productivo de mayor necesidad (¹²). Importantes avances se han realizado en la búsqueda de insumos que puedan sustituir los componentes esenciales del medio de cultivo (¹³, ¹⁴). Sustituciones en las sales minerales, vitaminas, fuentes de carbono y agentes gelificantes han sido evaluadas en diversos cultivos (¹¹, ¹⁵ - ²¹). Estas sustituciones buscan disminuir los costos de producción por medio de materiales e insumos más baratos, que fusionen sin alterar la calidad del material vegetal, y que permitan una mayor rentabilidad (²²).Durante más de 10 años, el Laboratorio de Biotecnología de Plantas de la Escuela de Agronomía del Instituto Tecnológico de Costa Rica ha venido evaluando sustituciones de insumos en la formulación de medios de cultivos para especies de interés comercial. Entre los cultivos evaluados con potencial para el desarrollo en las regiones de impacto de dicho Laboratorio, la raicilla ha despertado un gran interés por parte de pequeños y medianos productores interesados en la exploración del cultivo. Con el fin de evaluar diferentes sustituciones en la composición del medio de cultivo utilizado para la propagación de raicilla in vitro, se realizó una comparación del crecimiento de plantas de P. ipecacuanha en seis medios de cultivo.

Materiales y métodos

Ubicación del studio

La investigación sobre el efecto de la sustitución de insumos en el crecimiento in vitro de raicilla se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de Plantas (LBP) de la Escuela de Agronomía, Instituto Tecnológico de Costa Rica, Sede Regional San Carlos, Costa Rica.

Obtención de explantes

Se utilizaron plantas de raicilla (P. ipecacuanha) provenientes de condiciones estériles desarrolladas en el LBP. Para su propagación inicial, el material vegetal se mantuvo en condiciones in vitro en un medio con sales Murashige y Skoog (MS) (⁹), suplementados con 30 g/L de sacarosa y 6,2 g/L de agar como gelificante (pH=5,7). El material se mantuvo a 25 ± 2°C; con un fotoperiodo de 16 horas (28 μmol/m2·s) y subcultivos constantes en lapsos de 30 días.

Sustitución de insumos

Para la producción de medios de bajo costo, se realizaron sustituciones de precio menor a los reactivos tradicionales utilizados en la formulación del medio MS (el cual se utilizó como testigo). Se reemplazaron las sales minerales, vitaminas del complejo B y el agente gelificante según el cuadro 1. Los materiales (nudos de ~5 mm) se mantuvieron en los diferentes medios a 25 ± 2°C; con un fotoperiodo de 16 horas (28 μmol/m2·s) y subcultivos constantes en lapsos de 30 días. Se evaluaron diversas características de crecimiento (número de brotes, longitud de brotes, número de hojas y número de raíces) cada 15 días. El peso seco se evaluó una única vez al final del estudio a 90 días después de la siembra (dds).

Cuadro 1 Medios de cultivo evaluados en la sustitución de insumos durante el cultivo in vitro de Raicilla en el Laboratorio de Biotecnología de Plantas, Tecnológico de Costa Rica, 2017. 

Análisis de costos

Debido a las variaciones realizadas en los insumos para la formulación de los distintos medios evaluados, se realizó un análisis del costo (a un litro de medio preparado) de las sustituciones evaluadas con el fin de comparar los costos aproximados de cada medio de cultivo evaluado.

Diseño experimental y análisis estadístico

Se utilizó un diseño experimental de irrestricto completamente al azar, en el cuál se evaluaron 50 repeticiones para los seis tratamientos. La unidad experimental correspondió a un nudo de 5 mm de longitud (aproximadamente) evaluado cada 15 días hasta alcanzar los 90 dds, para un total de 1800 unidades muéstrales evaluadas. Cada explante se colocó en grupos de cinco por frasco de cultivo; los diez frascos utilizados por tratamiento se analizaron como covariable. La distribución de los tratamientos, los tiempos de evaluación y el frasco de cultivo se asignaron al azar a las unidades muestrales. Se realizó un análisis multivariado mediante exploración con el análisis de componentes principales y posteriormente un análisis de conglomerados para agrupar los tratamientos evaluados. Los grupos formados se valoraron mediante análisis de varianza multivariado y una prueba de comparación múltiple (Hotelling-Bonferroni).Los análisis de covarianza (ANCOVA) y comparaciones LSD Fisher; así como el análisis multivariado, se realizaron en el programa estadístico InfoStat/P (23) mediante análisis de modelos lineales generales.

Resultados y discusión

Crecimiento de los explantes en medios con sustitución de insumos

El número de brotes presentó un crecimiento sostenido para los seis tratamientos evaluados, mostrando dos brotes para los 60 dds y un máximo de tres brotes para los 90 dds (figura 1A). El medio de cultivo con sustitución de vitaminas por Tiamina fue el que presentó menor número de brotes (2,29 ± 0,82 brotes) en todo el periodo de evaluación. Este medio presentó diferencias significativas (p = 0,0081) con los demás medios con sustitución de insumos y el tratamiento testigo (MS) evaluados. El análisis del frasco como covariable (ANCOVA) no mostró diferencias significativas (p = 0,1372) para los tratamientos evaluados.En general, la producción de brotes fue baja en comparación con experimentos realizados por otros investigadores en la micropropagación convencional de raicilla (⁶, ⁸). Esto puede deberse a la ausencia de reguladores de crecimiento en los medios evaluados, los cuales tienden a estimular la producción de brotes adventicios (⁷). Por su parte, la sustitución de vitaminas MS por tiamina no dio el resultado esperado. Algunos investigadores (²⁴, ²⁵), señalan que esta vitamina está asociada a la producción de citoquininas y a la inducción de crecimiento en callos y el enraizamiento, por lo que resulta esencial para el desarrollo organogénico de plantas. En este estudio, la adición de solo la vitamina B1 no fue suficiente para mantener el crecimiento de los explantes; por su parte, el medio con Neurobión® como sustitución de vitaminas B1, B6 y B12 presentó un número de brotes similar a los obtenidos por el testigo (MS). Esto resalta la importancia de la incorporación de suplementos vitamínicos del complejo B en el medio de cultivo (²⁶). Con relación a la longitud de los brotes obtenidos, el crecimiento observado fue ascendente para todos los medios evaluados. Se presentó diferencia altamente significativa (p < 0,0001) entre los tratamientos evaluados y el testigo (MS); siendo los medios con sustitución de sales hidropónicas (27,74 ± 8,76 mm) y el medio con sustitución de vitaminas mediante la adición de Neurobión® (25,52 ± 7,75 mm) los que presentaron crecimientos similares a los mostrados por el medio MS (24,16 ± 6,99 mm). Los demás tratamientos presentaron longitudes inferiores a los 21,24 ± 5,23 mm para los 90 dds (figura 1B). El análisis de covarianza (ANCOVA) con el frasco como covariable, no mostró diferencias significativas (p = 0,1322) para los tratamientos evaluados. El crecimiento en longitud está fuertemente relacionado a la capacidad del medio de cultivo utilizado para solventar los requerimientos nutricionales de los explantes (²⁷). Siendo el nitrógeno y el potasio dos elementos de importancia al mantener las condiciones de crecimiento de los explantes (²⁸). Esto pudo favorecer al medio con sustitución de nutrientes mediante sales hidropónicas, las cuales presentaron los mayores crecimientos en longitud. Romero y colaboradores (¹⁶) por su parte obtuvieron crecimientos favorables en longitud de los explantes de Laelia anceps al utilizar sustitución de los nutrientes por fertilizantes comerciales al 50% en N y K respecto a las concentraciones del medio MS. En nuestro estudio, las sales hidropónicas presentaron efectos similares a los reportados por dichos investigadores.

Figura 1 Crecimiento obtenido en el cultivo in vitro de raicilla en diferentes medios con sustitución de insumos. Laboratorio de Biotecnología de Plantas, Tecnológico de Costa Rica, 2017. (A. Número de brotes; B. Longitud de brotes; C. Número de Hojas; D. Peso Seco, letras distintas representan diferencias significativas con a = 0,05). Las barras representan la desviación estándar. 

En el caso de los medios con sustitución de vitaminas por Tiamina, el uso una única vitamina restringió el crecimiento de los brotes, debido a la función de síntesis que realizan otras vitaminas del complejo B adicionadas al medio como que favorecen en el desarrollo de los explantes (²⁵). Por su parte los medios con sustitución de gelificante (Maicena y Bajo Costo), presentaron crecimiento disminuido debido a que los almidones presentes en el sustituyente pueden provocar una disminución en el crecimiento longitudinal de las plantas (¹⁵, ¹⁸).

Al comparar el número de hojas obtenido por los tratamientos evaluados se observó una diferencia altamente significativa (p < 0.0001) de la sustitución de Bajo Costo (Sales hidropónicas + Neurobión + Maicena), el cual presentó el menor número de hojas (5,68 ± 2,63 hojas) con respecto al testigo MS (11,68 ± 4,90 hojas). Los demás tratamientos presentaron valores crecientes inferiores a los obtenidos por el medio MS, siendo la sustitución de vitaminas con Neurobión (10,04 ± 4,20 hojas) la que presentó resultados más cercanos a los del tratamiento testigo a los 90 dds (figura 1C). Nuevamente, el análisis de covarianza (ANCOVA) no mostró diferencias significativas para el frasco como covariable (p = 0,5845).

Rodríguez (²⁹) obtuvo gran cantidad de hojas de P. ipecacuanha al sustituir los nutrientes con fertilizantes que equipararon las concentraciones del medio MS. En nuestro estudio la cantidad de hojas fue baja en comparación con el testigo para todos los tratamientos evaluados. No obstante, solo el tratamiento de Bajo Costo (al combinar las sustituciones de sales hidropónicas, Neurobión® y maicena) presentó el menor número de hojas desde los 60 dds y acentuándose a los 90 dds. Esta diferencia se le puede atribuir a las concentraciones bajas en nitrógeno y potasio (uno 50% inferiores en comparación con el MS) presentes en las soluciones hidropónicas utilizadas para la sustitución de las sales minerales. La importancia de estos minerales para la formación de nuevas hojas ya ha sido reportado con anterioridad (³⁰). Para este mismo tratamiento, la presencia de maicena como sustituyente al gelificante potenció un efecto sinérgico negativo disminuyendo el número de hojas debido a la reducción en la disponibilidad de nutrientes y afectando la absorción de agua (¹⁹).

Durante los 90 dds en los que se evaluó este estudio, no se presentó la formación de raíces en los explantes de raicilla. Aun cuando existen reportes de la producción de raíces en medios con sustitución de insumos (²⁹); este y otros trabajos relacionadas a la producción de raíces en P. ipecacuanha han requerido la adición de reguladores del crecimiento para dicho fin (⁶, ³¹). Una de las características de los medios de cultivo con sustitución de insumos implementados en este estudio es la ausencia de regulares de crecimiento, por lo que se podría justificar la falta de raíces debido a la carencia del estímulo apropiado. Además, el periodo de evaluación máximo fue de 90 dds, siendo un periodo corto para observar la producción de raíces en P. ipecacuanha sin ayuda de estimuladores hormonales, esto debido al lento crecimiento que presenta de forma general el cultivo (¹).

Al llegar los 90 dds, se realizó una evaluación del peso seco obtenido en cada tratamiento evaluado con respecto al testigo (MS). El medio de Bajo Costo (sustitución de sales hidropónicas con Neurobión® y Maicena) mostró el mayor valor de peso seco (55,82 ± 1,98 mg) en comparación al medio MS (46,30 ± 1,92 mg). Se presentó diferencia significativa (p = 0,0009) para los tratamientos evaluados, siendo los medios de bajo costo y maicena los de mayor peso seco obtenido (figura 1D). Nuevamente el análisis del frasco como covariable (ANCOVA) no mostró diferencia significativa (p = 0,2222).

Las diferencias observadas entre los pesos secos obtenidos pueden haberse visto influenciadas por la presencia de almidones como sustituyentes del gelificante; debido a que la presencia de almidones en el medio tiende a aumentar el peso seco de los explantes (³²). Por lo que las diferencias entre estos medios (Bajo Costo y Maicena) presentaron un peso superior a los observados en el medio con sustitución de sales hidropónicas y el MS (testigo).

Análisis multivariado

Para determinar cuál de las sustituciones de insumos favoreció el mayor crecimiento en los explantes de P. ipecacuanha, se realizó un análisis multivariado con el fin de evaluar las interacciones entre variables a los 90 dds. De esta forma el análisis de componentes principales estableció una relación entre los medios con sustitución de sales hidropónicas, los medios con Neurobión® como sustitución de vitaminas y el medio Testigo (MS); los cuales influenciaron la longitud de los brotes y el número de hojas. Por su parte el medio son sustitución de Maicena como agente gelificante ejerció su efecto sobre el número de brotes y el peso seco (figura 2A). Esta última variable también se vio afectada por el medio de Bajo Costo (sustitución de sales hidropónicas + Neurobión® + Maicena). De los tratamientos evaluados, el medio con sustitución de Tiamina como fuente de vitamina fue el que presentó los rendimientos más bajos. Esto se evidenció al ser el único medio evaluado que no tuvo un efecto positivo en las variables evaluadas.

Al tratar de evidenciar las similitudes entre los tratamientos mediante un estudio de conglomerados, la distancia Euclidea (0,870) mostró gran similitud entre los medios son sustitución de sales minerales, Neurobión® como sustitución de vitaminas y la sustitución de gelificante por maicena con el medio MS (figura 2B). De esta forma el análisis de conglomerados destacó a los medios con sustitución de vitaminas por tiamina como el medio con rendimientos más bajos y el medio de Bajo Costo como el tratamiento de mayores rendimientos (cuadro 2).

Figura 2 Análisis multivariado para el cultivo in vitro de raicilla en diferentes medios con sustitución de insumos a los 90 dds. Laboratorio de Biotecnología de Plantas, Tecnológico de Costa Rica, 2017. (A. Componentes principales; B. Conglomerados). 

Cuadro 2 Comparación entre las variables de crecimiento para el cultivo in vitro de raicilla en diferentes medios con sustitución de insumos a los 90 dds. 

Análisis de costos

La sustitución de componentes del medio de cultivo MS promovió un ahorro significativo en los costos de micropropagación de explantes de raicilla (cuadro 3). Los medios de cultivo que mayor ahorro presentaron fueron los medios con sustitución de sales hidropónicas y el medio de bajo costo. Los cuales mostraron un ahorro de 54% y 59% respectivamente, en comparación con el costo de preparación del medio testigo (MS). Este ahorro tan significativo se debe a los costos de importación requeridos para la compra de algunas sales minerales importantes en la composición del Medio MS, los cuales pueden tener precios muy elevados o que por su bajo requerimiento en el país solo se importa contra pedido por las casas comerciales que los comercializan en el país.

Cuadro 3 Costo aproximado de la composición base de un litro de diferentes medios con sustitución de insumos para el cultivo in vitro de P. ipecacuanha en el Laboratorio de Biotecnología de Plantas, Tecnológico de Costa Rica, 2017. 

Conclusiones

Gracias a este estudio, se estableció un sistema de propagación mediante medios con sustitución de insumos, los cuales permitieron la reducción de los costos de producción de medios y por consiguiente los de micropropagación de explantes de raicilla (Psychotria ipecacuanha). De los medios de cultivo evaluados, los medios con sustitución de sales minerales + Neurobión® + maicena como gelificante presentaron el mayor porcentaje de ahorro sin variar significativamente la integridad y calidad de los explantes producidos.

Agradecimientos

Un profundo agradecimiento a la Vicerrectoría de Investigación y Extensión del Instituto Tecnológico de Costa Rica, por el financiamiento del proyecto “Propagación Masiva de Raicilla (Psychotria ipecacuanha) mediante Sustitución de Insumos de Bajo Costo” (Centro Funcional 2151065); del cual deriva esta publicación.