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Introducción
La biotecnología, definida como la aplicación de tecnologías en sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados, es aquella en la que convergen diferentes disciplinas con el fin de generar procesos biológicos con aplicaciones industriales o productos de alto valor agregado comercializables (Bolívar, 2005). Estos procesos biotecnológicos dependen en gran medida de los organismos vivos utilizados, ya que, a diferencia de los procesos de manufactura industrial, cada uno cuenta con una biofábrica en su interior (Liese, 2005), aspecto que aumenta la dificultad de generar procesos estandarizados y controlados, ya que diferentes factores internos pueden afectar la respuesta del organismo, influyendo en las mermas o reprocesos (Kandelbauer et al., 2012).
Un ejemplo de este tipo de procesos es la producción comercial de plantas in vitro, que es una de las industrias biotecnológicas más difundidas en el área de la biotecnología vegetal. Este proceso incluye una serie de técnicas para la propagación masiva de plantas seleccionadas de acuerdo con sus características sobresalientes (rendimiento, fenotipo, genotipo, etc.), en el que se parte de explantes como meristemos, yemas, ápices, semillas y embriones, que son colocadas en un medio de cultivo estéril adecuado con nutrientes y hormonas. Estos explantes son inducidos a regenerar plantas completas que conservan las características del material madre del cual se originaron. Las plantas in vitro resultantes son clones o copias genéticamente idénticas entre sí e idénticas a la planta madre, excepto cuando el explante inicial es una semilla o embrión cigótico (George, 2008).
El proceso de transformación productiva se inicia con la selección del material parental, continúa con una serie de ciclos de multiplicación hasta dar con el número final de plantas requerido y termina cuando las plantas son inducidas al enraizamiento. Este proceso de producción, precisamente por manejar material vivo, está expuesto a una serie de factores que provocan variabilidad (genotipo, condiciones físicas y químicas), aunado a la posibilidad de pérdidas de material por contaminación y defectos en el crecimiento y desarrollo (George & Davies, 2008; Bolívar, 2005). Resulta entonces un reto estimar la capacidad del proceso, debido a que las pérdidas por desecho y reproceso, tienen un comportamiento probabilístico y es necesario tener en cuenta muchas variables aleatorias al mismo tiempo.
Los métodos estocásticos constituyen una herramienta para el estudio de procesos donde se toman en consideración las variables aleatorias. Un proceso estocástico es aquel cuyo comportamiento no es determinista y se caracteriza por acciones predecibles y con un elemento aleatorio de probabilidades tomando en cuenta la variabilidad (Allen, 2010; Lawler, 2006), donde las variables evolucionan a lo largo del tiempo de forma total o parcialmente aleatoria.
Uno de los modelos más utilizados es el de las Cadenas de Markov, propuesto por el matemático ruso Andrey Markov en 1906 con base en métodos probabilísticos dependientes del último evento precedente (Markov, 1906); poseen la peculiaridad de tener memoria, recordando el último evento y, por ende, este condiciona las posibilidades de los eventos futuros. Así, un proceso de Markov es aquel en el que, para predecir el comportamiento futuro de la variable aleatoria, únicamente es relevante su valor actual. Su aplicación en procesos productivos se realiza luego de tener información y análisis de tiempos de producción, producto desechado y reprocesos (Kirkwood, 2015).
Con este trabajo se pretende brindar una herramienta para que las empresas dedicadas a esta industria puedan determinar con mayor certeza su capacidad productiva, partiendo de parámetros simples, como el número de plantas iniciales requeridas para lotes específicos y probabilidades por etapa para la transformación en producto final.
Metodología
Descripción del proceso de producción
El estudio se realizó tomando como modelo un sistema productivo de plantas in vitro de papa (Solanum tuberosum) en la empresa VitroPlant S.A., en Cartago, Costa Rica.
Se estudió y describió el proceso para la obtención de vitroplantas y, con datos históricos, se establecieron los tiempos de producción para las etapas.
Aplicación del modelo de Cadenas de Markov
Se aplicó el modelo de Cadenas de Markov para determinar el número de explantes iniciales que se requiere establecer para obtener un número definido de lote de producción (3,000 plantas finales mediante tres ciclos de multiplicación in vitro), según la estandarización de la empresa.
Se estableció un registro histórico del número de plantas que fueron desechadas, reprocesadas y aquellas que continuaron su ciclo de reproducción. Se calculó la matriz de transición de Markov tomando en cuenta un 95% de éxito en la etapa de enraizamiento y la transición al empaque final, según registros de la empresa.
A partir de la matriz obtenida, se estimaron las probabilidades de los estados adsorbentes (empaque y desecho) de cada etapa, mediante las operaciones matriciales:
Resta de Matriz Identidad con Matriz Transitoria: (I-N)
Matriz Inversa de 1-N: Minversa(I-N)
Multiplicación de la Matriz Inversa por la Matriz Absorbente: Minversa(I-N)*M(A).
Con el cálculo de las probabilidades anteriores, se planteó una fórmula para obtener el número de plantas requeridas para cumplir con el lote de producción final, de acuerdo con la etapa en la que se encuentre el material vegetal.
En esta fórmula, se presentó una relación entre el número de plantas deseadas, el coeficiente de multiplicación, el número de ciclos de multiplicación y la probabilidad correspondiente según la matriz de Markov.
donde:
N d = Número de plantas deseadas
CM = Coeficiente de Multiplicación
Nciclos = Número de ciclos de multiplicación
P ij = Probabilidad de acuerdo a Markov (Factor Markov) dependiendo de donde se inicie el proceso.
El coeficiente de multiplicación utilizado fue de 3,74 y representa la relación de plantas finales entre plantas iniciales. Se obtuvo mediante el promedio de tres ciclos de multiplicación históricos de la empresa. Los cálculos se realizaron con el software Microsoft Excel 2010.
Resultados y discusión
Descripción del proceso de producción
El proceso productivo consiste en utilizar brotes axilares con capacidad regenerativa, obtenidos de campo o invernadero, que son desinfectados superficialmente e introducidos en medios nutritivos estériles bajo condiciones físicas controladas (temperatura, luz, humedad y fotoperiodo). Esta etapa es el establecimiento in vitro, durante el cual los brotes se activan en las condiciones artificiales de laboratorio y se seleccionan para la siguiente etapa aquellos que no presenten contaminación ni anormalidades. Estos brotes activados regeneran plantas completas durante un tiempo variable de incubación controlada y se utilizan para la etapa de multiplicación del material cuando alcanzan la altura y el desarrollo adecuados; estas plantas también pueden colocarse bajo condiciones de conservación (temperatura, nutrientes y luz reducidos) para tomarlas en el momento que se requieran para multiplicarlas.
Luego del establecimiento se inicia la etapa de multiplicación in vitro, en la que los operarios toman las plantas que los brotes generaron y las seccionan en explantes tipo microestacas y nuevamente se cultivan en medios nutritivos frescos a razón de cuatro microestacas por frasco, lo que se conoce como subcultivo.
Entre cada ciclo de subcultivo se define un período de incubación (aproximadamente 30 días) en cuartos controlados, durante los cuales el producto se transforma debido a procesos biológicos inducidos.
Durante la labor de subcultivo, los operarios, además de seccionar el material y cultivarlo, lo inspeccionan y reprocesan aquellas plantas del lote de producción que no lograron el desarrollo adecuado, regresándolas a una etapa anterior.
El período de incubación, aunque no implica manipulación de las plantas, se considera una operación debido a que ocurre transformación (biológica) del producto; también hay desecho (básicamente por contaminación) y reproceso (caída de plantas, presencia de oxidación, por ejemplo), lo que obliga a un recultivo en esta etapa. De esta forma, la etapa de multiplicación implica ciclos de crecimiento exponencial del material, los cuales finalizan de forma inducida, cuando se llega al número final de explantes que potencialmente generaran las plantas requeridas para un lote. En este momento se transfieren a un medio de cultivo diferente que les permite desarrollarse en plantas y generar raíces, de manera que están listas para ser empacadas y transferidas a condiciones de invernadero.
En todo el proceso de producción se tienen dos estados absorbentes, correspondientes al descarte y al producto terminado empacado al final.
El Cuadro 1 muestra información de cada una de las etapas involucradas en el proceso de producción.
Cuadro 1 Etapas del proceso de producción de plantas in vitro de papa (Solanum tuberosum).
| Código | Nombre | Tiempo (días) |
|---|---|---|
| DE | Desinfección | 1 |
| INT | Introducción | 1 |
| Stock | Almacenamiento en banco de germoplasma | <1 año |
| INS | Inspección I | 1 |
| CM I | Ciclo multiplicación I | 1 |
| IEI II | Incubación e inspección II | 30 |
| CM II | Ciclo multiplicación II | 1 |
| IEI III | Incubación e inspección III | 30 |
| CM III | Ciclo multiplicación III | 1 |
| IEI IV | Incubación e inspección IV | 30 |
| ENR | Enraizamiento | 1 |
| IEI V | Incubación e inspección V | 30 |
| EMP | Empaque | 1 |
La Figura 1 muestra la secuencia de las etapas, así como las probabilidades de que en cada caso el material se descarte o sea reprocesado.
Aplicación del modelo de Cadenas de Markov
En la Figura 2 se presenta la matriz de transición de Markov, tomando en cuenta un 95% de éxito en la etapa de enraizamiento y la transición al empaque final.
Como resultado de las operaciones matriciales, se calcularon las probabilidades para los estados absorbentes, que se presentan en el Cuadro 2.
Cuadro 2 Probabilidades de los estados adsorbentes del proceso de producción de plantas in vitro.
| Etapa | Empaque | Desecho | |
|---|---|---|---|
| STK | Stock | 0,707 | 0,294 |
| INS | Inspección | 0,707 | 0,294 |
| CM I | Ciclo multiplicación I | 0,786 | 0,215 |
| IEI II | Inspección e incubación II | 0,786 | 0,215 |
| CM II | Ciclo multiplicación II | 0,803 | 0,198 |
| IEI III | Inspección e incubación III | 0,803 | 0,198 |
| CM III | Ciclo multiplicación III | 0,821 | 0,180 |
| IEI IV | Inspección e incubación IV | 0,821 | 0,180 |
| ENR | Enraizamiento | 0,902 | 0,097 |
| IEI V | Incubación e inspección V | 0,950 | 0,050 |
De acuerdo con el cuadro anterior, para la columna de empaque se observa que las probabilidades de que una planta llegue hasta producto terminado aumentan conforme se avanza en las etapas del proceso de producción. Así, por ejemplo, la probabilidad de que una planta que se tome del stock y se convierta en producto terminado es menor (0,707) en comparación con una planta que se tome del ciclo de multiplicación III (0,821). Esta probabilidad involucra el reproceso que sufren las plantas en las respectivas etapas de inspección y ciclos de multiplicación.
Desde el punto de vista biológico, el comportamiento ascendente de los valores de probabilidad a lo largo del proceso para que las plantas se conviertan en producto terminado, es un reflejo de la adaptación de los individuos a las condiciones de producción, conforme se avanza en el procedimiento. Con respecto a las probabilidades de desecho, se evidencia un comportamiento descendiente, en que se pierden menos plantas conforme se avanza en el proceso. Aunque la contaminación es un factor muy variable, otras fuentes de pérdida, como la muerte de las plantas, puede estar incidiendo en esta tendencia; es decir, es probable que la cantidad de plantas que se pierden por mortalidad disminuya conforme se avanza en el sistema, debido a una mejor adaptación a las condiciones de crecimiento (Berthouly & Etienne, 2005).
Con la ecuación; 
, se estimó el número de plantas iniciales requeridas para la producción de un lote final de 3,000 vitroplantas para aclimatación. Para el coeficiente de multiplicación de la etapa de enraizamiento se utilizó un valor de 1, porque en esta fase únicamente se hace un cambio de medio de las plantas generadas por el ciclo de multiplicación III sin segmentarlas (Cuadro 3).
Cuadro 3 Estimación de plantas iniciales requeridas para la obtención de un lote de 3,000 plantas in vitro.
| Componentes de fórmula | STOCK | CM I | CM II | CM III | ENR |
|---|---|---|---|---|---|
| Plantas deseadas | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 |
| Coeficiente multiplicación | 3,74 | 3,74 | 3,74 | 3,74 | 1,00 |
| Ciclos multiplicación | 3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| Probabilidad | 0,707 | 0,786 | 0,803 | 0,821 | 0,902 |
| Plantas iniciales | 81 | 272 | 998 | 3655 | 3324 |
| Desecho | 24 | 59 | 198 | 659 | 324 |
| Plantas disponibles | 57 | 214 | 800 | 2996 | 3000 |
STK= Banco de germoplasma
CM= Ciclo de Multiplicación
ENR= Enraizamiento
De esta forma, se requieren 81 plantas para obtener 3,000 finales, si se parte del stock inicial, el cual se encuentra a una distancia de tres ciclos de multiplicación para luego enraizar y posteriormente empacar las plantas. De manera análoga, si se parte del ciclo de multiplicación I, se requieren 272 plantas para obtener 3,000 finales; en comparación con el dato obtenido para el stock, este valor es mayor debido a que atravesará menos ciclos de multiplicación (dos ciclos). Si se parte de los ciclos de multiplicación II y III, se requieren 998 y 3,655 plantas, respectivamente. Con respecto al número de ciclos requeridos si se parte del ciclo III, el valor es cero, debido a que este es el último que se contempló en el proceso, quedando solo la etapa de enraizamiento, la cual no es considerada un ciclo de multiplicación (Cuadro 3).
Conclusiones
Las Cadenas de Markov se perfilan como una herramienta válida para implementarse en procesos de manufactura estocásticos, en los que intervienen organismos vivos y procesos biológicos. En este caso se logró demostrar, con un correcto registro de datos históricos, cuales son los requerimientos iniciales de material vegetal según la etapa en la que se encuentre el proceso para lograr una demanda específica, aplicando las probabilidades obtenidas a través de las Cadenas de Markov. El modelo aplicado puede ajustarse a otras especies y variedades diferentes a Solanum tuberosum, que presenten coeficientes de multiplicación y patrones particulares de crecimiento y desarrollo.
Con un adecuado cálculo de material vegetal de entrada al proceso, se pueden estimar de forma más confiable y realista los costos y tiempos de producción, pues se conocen las probabilidades de que el producto se convierta en desecho o reingrese al sistema por reproceso, aunque al sistema solo reingrese material vegetal y no los demás materiales de soporte. Estas herramientas de estimación permiten maximizar recursos y planear de mejor forma el manejo de las mermas y reprocesos.
Para el caso en estudio, se determinó que para una demanda de 3,000 plantas, se debe iniciar con 81, 272, 998, 3,655 y 3,324 plantas si se parte de la etapa de stock, CM I, CM II, CM III y enraizamiento, respectivamente.
El valor que agrega el análisis estadístico en estos procesos con variabilidad inherente al tipo de producto biológico, radica en la precisión con que se estiman los tiempos de entrega de acuerdo con su capacidad y el comportamiento particular de cada especie.
