Procedencia y procesamiento de las muestras

Para el cálculo de los parámetros genéticos poblacionales, se contó con un total de 950 muestras de pelo de animales Brahman (7 sementales, 788 vacas, 155 crías) registrados en la Asociación de Criadores de Ganado Cebú de Costa Rica. Estas muestras fueron recolectadas durante 2015 y 2016, y procedieron de 13 hatos voluntarios entre los 17 participantes en el Programa Nacional de Evaluación Genética de la raza Brahman (^{Cruz Méndez 2015}).

El material de muestreo consistió en folículos pilosos de la raíz de la cola del bovino, arrancados manualmente mediante un solo movimiento rápido y continuo a contrapelo, se siguieron las recomendaciones de ^{Cordero et al. (2013}). Se corroboró que las muestras fueran de pelo seco, libre de excrementos y orina. Estas muestras fueron colocadas en sobres individuales con la información del animal y el hato de procedencia.

La extracción del ADN fue realizada en el Laboratorio de Bioseguridad del LANASEVE del Servicio Nacional de Salud Animal del estado (SENASA); se seleccionaron aproximadamente 30 pelos de la cola con folículo, según el procedimiento descrito por ^{Cordero et al. (2013}).

La amplificación de ADN por PCR se realizó utilizando el kit Thermo Scientific™ Bovine Genotypes Panel 3.1. Este kit incluyó un total de 18 marcadores, 12 de los cuales corresponden a los recomendados por ISAG (^{FAO 2011}) para uso en pruebas de parentesco en bovinos (BM1818, ETH10, TGLA122, BM2113, SPS115, BM1824, INRA023, TGLA126, TGLA53, ETH3, ETH225, TGLA227). El kit incluyó otros 6 marcadores adicionales (CSSM66, ILSTS006, CSRM60, SPS113, MGTG4B y RM067). El cromosoma de localización de cada marcador, el rango del tamaño de los alelos y la secuencia de los cebadores que los delimitan se detallan en ^{Campos (2017}).

Los productos de la amplificación fueron sometidos a electroforesis capilar al utilizar un analizador genético ABI 3130, según el procedimiento descrito por ^{Cordero et al. (2013}). Los polimorfismos de los microsatélites fueron discriminados de acuerdo con sus patrones de fluorescencia y tamaño. Los datos se visualizaron e identificaron mediante el software GeneMapper v3.0 (^{Applied Byosistems 2002}).

Estimación de parámetros genéticos poblacionales

Los perfiles genéticos obtenidos en el paso anterior fueron analizados mediante el programa Cervus (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}) y se obtuvieron los siguientes parámetros genéticos poblacionales: el número total de alelos por marcador (Na), el número efectivo de alelos (Ne= 1/Σp ² , con p= frecuencias alélicas por marcador), la heterocigosidad observada (Ho, obtenida como la proporción de individuos heterocigóticos en la muestra), la heterocigosidad esperada(He = Ho 1 - Σ _i =1 P ₁ ²);el índice defijación ( ), y el contenidode información polimórfica(CIP = 1 - Σⁿ _i =1P ₁ ² _-(Σ _i ⁿ =1Σ _j ⁿ =i = 12p _i ² p _j ²)Además, se evaluó la hipótesis de equilibrio Hardy-Weinberg al utilizar la prueba Chi-cuadrado y se obtuvo un estimado de la frecuencia de alelos nulos (^{Summers y Amos 1997}).

Probabilidades de identidad y exclusión

Para evaluar la eficiencia del set de marcadores como herramienta para pruebas de verificación de identidad y paternidad en la población Brahman local, se obtuvieron estimados de Probabilidad de Identidad (PI y PI _SIBS ) para cada locus mediante el módulo de identidad del programa Cervus (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}). PI se obtiene a partir de la fórmula según ^{Waits et al. 2001}

Se interpreta como la probabilidad de que 2 individuos seleccionados aleatoriamente en la población presenten genotipos idénticos para un locus.

PI_SIBSse obtiene como:

Se interpreta como la probabilidad de que 2 hermanos completos seleccionados en la población presenten genotipos idénticos para un locus. PI _SIBS es un estimado más conservador recomendado en poblaciones consanguíneas o con desviaciones marcadas del equilibrio Hardy Weinberg.

La Probabilidad de Identidad Combinada (PIC) para el set de marcadores se calculó como el producto de las PI específicas de cada marcador.

Seguidamente, se calculó la probabilidad de exclusión (^{Jamieson y Taylor 1997}), definida como la probabilidad de que un individuo seleccionado aleatoriamente de la población sea excluido como potencial padre de una cría. Esta probabilidad se obtuvo para los siguientes 3 casos de evaluación de paternidad:

a) PE_1P: Un padre candidato, otro padre conocido, calculado como

PE_2P: Un padre candidato, otro padre desconocido, obtenido como:

c) PE_PP: Par de padres candidatos:

El cálculo de Probabilidades de Exclusión Combinadas (PEC) para el set completo de marcadores se realizó mediante la fórmula:

Verificación de paternidad en 3 hatos

Una vez confirmada la eficiencia del set de marcadores, se realizó una evaluación de la integridad de las paternidades reportadas en 3 de los hatos, según anuencia de sus propietarios, para lo cual se contó con los perfiles genéticos de 155 crías, entre las cuales 118 contaron con el perfil genético de ambos padres, 19 contaron solo con el perfil genético de sus madres y los 18 restantes contaron solo con el perfil de genético de sus padres. Para estos casos, los perfiles genéticos fueron comparados mediante el módulo Par de Padres con Sexo Conocido del programa Cervus (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}) y se contabilizaron los casos de discordancias de genotipo entre progenie vs. padres candidatos.

Para cada padre candidato y cada locus se obtuvo un estimado de la razón de verosimilitud LR = x/p, donde x es la probabilidad de transmisión del alelo obligado (1 para homocigotas y 0,5 para heterocigotas) y p es la frecuencia de la variante alélica respectiva. La existencia de padres conocidos permitió la identificación de los alelos obligados. LR se interpreta cómo cuántas veces más (o menos) posibilidad tiene el padre candidato de ser el verdadero padre de la cría que de no serlo. LR se ajustó, además, por la tasa de error de genotipado, estimada a partir del análisis de discordancias padres vs. progenie.

Finalmente, se calculó el Score LOD, calculado como el logaritmo natural del producto de las LR de todos los loci. Este score permite discriminar entre varios padres potenciales, aun en presencia de errores de genotipado. Los Score LOD fueron cotejados contra distribuciones de probabilidad obtenidas a partir de simulación por remuestreo (Boostrapping), con el fin de determinar el nivel de confianza logrado en la asignación de las paternidades. Se asumieron parámetros de simulación en función de las características de la población analizada, entre ellos: tasa de error de genotipado: 7%, madres candidatas: 118, padres candidatos: 7, porcentaje de padres y madres genotipados: 75%, parentesco entre padres verdaderos: 3%, proporción de la población consanguínea: 10%. El tamaño de progenie simulada fue de 100000 individuos, según lo sugerido por ^{Marshall et al. (1998}) y ^{Kalinowski et al. (2007}). Se obtuvieron los valores críticos de LOD para rechazo de paternidad con niveles de 95 y 99% de confianza y se compararon los porcentajes de rechazo de paternidad de los 3 hatos mediante prueba de chi-cuadrado y comparaciones pareadas de proporciones.

Parámetros de diversidad alélica

El promedio de alelos observados por marcador fue de 11,5 (Cuadro 1), el cual oscila entre 6 (BM1824, ETH10) y 17 (SPS113). Muchos alelos se presentaron en frecuencias muy bajas (<1%), por lo que el promedio efectivo de alelos por marcador fue de solo 3,76. El número de alelos observados es menor al reportado por estudios similares, por ejemplo 14,2 (^{Hernández et al. 2009}), 13,9 (^{Gómez et al. 2013}) o 12 (^{Martínez et al. 2015}). Esto se debe probablemente a los mayores tamaños de muestra utilizados en dichos estudios, lo que permitió identificar alelos suplementarios, y también, a la mayor heterogeneidad racial de dichas poblaciones, ya que incluyeron animales no registrados de poblaciones comerciales.

La heterosis observada fue menor que la esperada para casi todos los marcadores, con excepción de INRA23 y SPS115 (Cuadro 1). Los promedios de heterosis observada y esperada fueron de 0,67 y 0,70, respectivamente. Las desviaciones (Ho-He) oscilaron entre 0 (TGLA122) y 0,13 (TGLA126). El índice de fijación (F) osciló entre -0,02 (INRA23 y SPS115) y 0,16 (ILSTS006), con un promedio 0,04. Esto sugiere una tendencia a la consanguinidad en la población analizada, lo cual es de esperar en una población de animales registrados altamente emparentados, sometidos a selección y con apareamientos dirigidos (^{Cervini et al. 2006}, ^{Gómez et al. 2013}). Es probable que estas mismas razones causaran que la prueba de equilibrio Hardy-Weinberg fuera significativa para 9 de los 18 marcadores (Cuadro 1).

Todos los marcadores utilizados estuvieron en la categoría de altamente informativos (CIP>0,5), a excepción del marcador ETH225 (CIP=0,44), considerado medianamente informativo (Cuadro 1). Los demás marcadores se encontraron en el rango de CIP entre 0,53 (BM1824) y 0,88 (TGLA122), con un promedio de 0,66. Estudios previos en animales de registro reportaron promedios de CIP muy similares, tales como 0,64 (^{Cervini et al. 2006}), 0,66 (^{Hernández et al. 2009}) o 0,65 (^{Gómez et al. 2013}). Otros estudios en poblaciones comerciales reportaron valores superiores, tales como 0,70 (^{Carolino et al. 2009}), 0,72 (^{Stevanovic et al. 2010}) o 0,75 (^{Martínez et al. 2015}). Esto puede ir ligado a la mayor heterogeneidad racial presente en dichas poblaciones.

La frecuencia promedio de alelos nulos fue de 0,02 (Cuadro 1), con los valores más altos para BM1818 (7%) y ILSTS006 (9%). De acuerdo con ^{Cervini et al. (2006}), altas frecuencias (>5%) de alelos nulos pueden causar también una deficiencia de heterocigosidad y desviaciones aparentes del equilibrio de Hardy-Weinberg en los loci. Asimismo, en las pruebas de parentesco pueden dar origen a falsos negativos en la asignación de padres y madres.

Probabilidades de identidad y exclusión

Mediante el uso combinado de los 18 marcadores se obtuvieron valores de PIC de 2,4×10¹⁷ y 2,6×10^-7 (Cuadro 1). Los loci con mayor poder discriminatorio, o sea menor PI, fueron TGLA122 y TGL126, que a su vez fueron los que presentaron mayor heterocigosidad y CIP. Por el contrario, el locus de menor poder discriminatorio fue ETH225, para el cual existió un alelo altamente predominante con frecuencia de 0,70. Es importante señalar que la informatividad de un marcador puede variar en función de la raza. En un estudio previo a nivel local, que incluyó diversos tipos raciales (^{Cordero et al. 2015}), el marcador ETH225 mostró una distribución más homogénea de sus alelos, con un valor de 0,29 para el alelo más frecuente y un valor de CIP de 0,79, muy superior al 0,44 obtenido en el presente estudio.

En cuanto a las probabilidades de exclusión, los resultados indicaron que los loci con mayor poder de exclusión fueron nuevamente TGLA122 y TGL126, y el de menor poder el ETH225 (Cuadro 1). Las probabilidades de exclusión combinadas fueron en todos los casos mayores a 0,999, por lo que son consideradas satisfactorias para pruebas de paternidad.

En un estudio previo a nivel local se reportó una PEC de 0,999 con el uso de 18 marcadores en animales comerciales de diferentes características raciales (^{Cordero et al. 2013}). Otros estudios similares en la raza Brahman reportan valores semejantes, tales como 0,999 (^{Riojas et al. 2009}) y 0,993 (^{Gómez et al. 2013}), con el uso de 11 y 8 marcadores, respectivamente. Algunos estudios en otras razas reportaron valores de PEC que variaron de 0,842 a 0,999 al utilizar entre 6 a 10 marcadores microsatélite (^{Baron et al. 2002}, ^{Curi y Lopes 2002}, ^{Visscher et al. 2002}, ^{Carolino et al. 2009}). En todos los estudios se reitera la importancia del uso de los marcadores con mayor poder discriminatorio, ya que al descartar marcadores de baja informatividad, se puede aumentar la PEC con un menor número de marcadores. En el caso específico del presente estudio, el marcador ETH225 fue de poca utilidad por su bajo poder discriminatorio.

Análisis de discordancias por locus

En el análisis de discordancias por locus se observó que un 66% (38/58) y un 50% (24/48), de los genotipos discordantes en madres y padres reportados, respectivamente, podrían ser atribuidos a alelos nulos (Cuadro 2). La tasa promedio de error de genotipado fue alta (10,8 y 9%), no obstante, es probable que este sea un valor sobreestimado, ya que en su cálculo se asume que los padres conocidos han sido identificados con 100% de certeza (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}). Algunos loci presentaron estimados de tasas de error de genotipado ≥15%, tales como: BM1818, ETH225, ETH3, TGLA227, y TGLA53. Las variables tasas de error de genotipado entre loci sugieren que puede haber un subconjunto de loci que no se puede genotipar con fiabilidad, o que pueden tener alelos nulos segregándose en frecuencias moderadas o altas (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}). En estos casos, una alternativa es omitir del análisis de parentesco estos loci (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}).

Las tasas de error para ambos casos, padre o madre conocida, fueron distintas para algunos loci (BM1818, ETH225, ETH3, MGTG4B, RM067, TGLA227). Esto podría deberse a la gran diferencia entre el número de padres (n=7) y madres (n=137) incluidos en el presente estudio, así como a la gran heterogeneidad en las distribuciones alélicas de distintos loci. Por otra parte, la estimación de la tasa de error de genotipado puede verse sesgada por falta de independencia (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}). Una causa obvia de no independencia ocurre cuando existe descendencia múltiple de un mismo padre, hecho que sucedió en el presente estudio con los sementales.

Análisis de paternidad por exclusión

El análisis de paternidad por exclusión permitió identificar un 58% de perfiles perfectamente compatibles en el caso de madre vs. progenie y 65% en el caso de padre vs. progenie (Cuadro 3). En el caso de tríos (padre vs. madre vs. progenie) solo un 35% de los casos presentó compatibilidad perfecta. Es importante notar que la mayoría de discordancias involucraron solo 1 o 2 loci. Se aprecia nuevamente que un gran número de estas discordancias podrían ser atribuidas a alelos nulos. Los estudios de exclusión requieren al menos 2 loci discordantes entre el candidato y la descendencia para dar cuenta de los errores de tipificación o mutaciones (^{Jones et al. 2010}). En presencia de altas tasas de error y alelos nulos, los casos de una o 2 discordancias probablemente son casos de paternidades correctas, donde las discordancias son causadas por los factores mencionados. Por el contrario, los casos con 3 o más discordancias es más probable que se deban a paternidades incorrectamente reportadas o errores en la identificación de las muestras, ya sea a nivel de campo o en el proceso de laboratorio (^{Marshall et al. 1998}, ^{Kalinowski et al. 2007}).

Al aplicar el criterio de exclusión basado en al menos 2 loci discordantes (^{Jones et al. 2010}), los porcentajes de rechazo de paternidad en el presente estudio fueron altos, con valores de 18,2% en las madres, 14,0% en los padres y 34,6% en los tríos. Los resultados reportados por estudios similares son variables. ^{Carolino et al. (2009}) reportaron paternidades erróneas, con discordancia en 2 o más loci, de 14% en madres y 7% en padres. Se han reportado tasas más altas de paternidades erróneas en ganado Gyr de Brasil (^{Curi y Lopes 2002}), con 27,5% de rechazo en las paternidades (padre vs progenie vs. madre). ^{Baron et al. (2002}), reportaron una tasa de identificación errónea (padre vs. progenie) de 36% y 22% en al menos 1 o 2 marcadores, respectivamente. Por otra parte, ^{Rehout et al. (2006}) reportaron porcentajes de paternidad errónea en ganado Holstein de 10,7%.

Existen varios factores que pueden causar discordancia entre perfiles genéticos de padres y progenie, entre los que se mencionan: el registro inadecuado de los animales al momento de la parición, la identificación incorrecta del semen, mal control visual de montas o inseminación artificial y la mala asignación de padres por uso de múltiples toros en grupos de cría (^{Baron et al. 2002}, ^{Carolino et al. 2009}).

Análisis de paternidad por índices de verosimilitud

En el análisis basado en índices de verosimilitud se observó que los promedios de score LOD disminuyeron conforme aumentó el número de loci discordantes, hasta tomar valores negativos (Cuadro 3). Un valor negativo significa que la probabilidad de paternidad incorrecta es mayor que la de paternidad correcta. En el caso de los padres 3 discordancias fueron suficientes para producir LOD negativos, mientras que en las madres el número requerido fue de 4 y en los tríos se incrementó hasta 8. Esto refleja que el principio de exclusión basado en al menos 2 loci discordantes puede ser insuficiente en algunos casos de discriminación de paternidad.

La evaluación de paternidades mediante valores críticos de LOD mostró que, aun con un nivel de confianza de 95%, existió un alto porcentaje de paternidades rechazadas (Cuadro 4), es decir, probablemente incorrectas. El porcentaje de paternidades rechazadas en madres (24,1%) prácticamente duplicó el de los padres (12,5%). En el caso de las madres, el criterio de rechazo de paternidad basado en valores críticos de LOD (24,1% de rechazo, confianza 95%) resultó ser más estricto que el basado en el criterio de exclusión (18,2% de rechazo, ≥2 discordancias). Se detectaron 10 casos de incongruencias entre ambos métodos, de los cuales 9 correspondieron a situaciones donde se aceptó la maternidad cuando se utilizó el criterio de exclusión, mientras que se rechazó al utilizar el valor crítico de LOD (95%). Estas diferencias se deben a que el principio de exclusión no toma en cuenta las frecuencias de los alelos discordantes, los errores de genotipado o la probabilidad de transmisión de los alelos obligados.

En el caso de los padres ambos criterios produjeron resultados muy similares (14% vs. 12,5% de rechazo), con solo 2 casos de resultados incongruentes, ambos rechazados por el principio de exclusión y aceptados por el criterio LOD. En los tríos se observó que el criterio basado en exclusión fue más estricto (34,6% rechazo) que el basado en valores críticos de LOD (26,3% rechazo, 95% confianza). Se identificaron 18 casos incongruentes, de los cuales 14 se rechazaron mediante el criterio de exclusión, mientras que se aceptaron al utilizar el valor crítico de LOD (95%).

El análisis de paternidades rechazadas por hato, basado en valores críticos LOD, demostró que el hato 1 presentó menores porcentajes de rechazo (Cuadro 5). La mayor proporción de rechazos en los casos madre vs. progenie se dieron en el hato 3, mientras que en los casos padre vs. progenie el mayor problema se presentó en el hato 2. Para los tríos las diferencias no fueron significativas, pero la tasa de rechazo tendió a ser mayor en los hatos 2 y 3. En el hato 2 la proporción de casos rechazados es alta tanto en madres como padres, mientras que en los hatos 1 y 3 el problema solo se observa en las madres. Un estudio similar en 4 hatos de ganado Boran (^{Kios et al. 2012}) reportó bajas tasas de rechazo, entre 0 y 5%, para los casos madre vs. progenie, mientras que en los casos padre vs. progenie las tasas de rechazo variaron desde 4,3 hasta 80%.

En el presente estudio, las diferencias observadas entre hatos pueden estar ligadas a distintos niveles de eficiencia y rigurosidad tanto en el control de los apareamientos como en la toma de los registros. En el caso del hato 1, se comprobó que existe un mayor nivel de supervisión, lo que es consistente con los menores porcentajes de paternidades rechazadas. En el hato 2 se comprobó que el nivel de supervisión es menor, el manejo del hato es más extensivo y se utiliza la monta natural en la mayoría de los apareamientos. Esto puede explicar los altos porcentajes de rechazo en padres vs. progenie, probablemente asociados a la falta de control al reportar los padres o al momento de las montas.

Por último, se comprobó que el hato 3, aunque cuenta con profesionales a cargo, tiene una menor supervisión y orden en el manejo de los registros. Además, en este hato existe un lote de vacas que presentan problemas para la obtención de pedigríes de sus crías por falta de actualización de la información en la asociación.

En conclusión, los resultados obtenidos reflejan que el set de marcadores utilizado provee una capacidad discriminatoria satisfactoria para fines de verificación de identidad y parentesco. La verificación de paternidad mediante criterios de exclusión basados en un mínimo de 2 loci discordantes puede ser insuficiente en algunos casos, ya que no considera la frecuencia de los alelos implicados en la población. En este sentido, los índices de verosimilitud tienen mayor poder discriminatorio, puesto que consideran las frecuencias alélicas y las probabilidades de transmisión, al ser más útiles sobre todo cuando se trata de excluir entre varios padres potenciales. Los resultados hacen ver, además, la necesidad de implementar en los hatos mejores mecanismos de control en los apareamientos y en la toma de registros genealógicos.