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Agronomía Costarricense

versão impressa ISSN 0377-9424

Agron. Costarricense vol.38 no.1 San Pedro de Montes de Oca Jan./Jun. 2014

 

Caracterización molecular mediante rep-PCR de aislados nativos de Bacillus thuringiensis, obtenidos de muestras de suelo

Molecular characterization using rep-PCR of native isolates of Bacillus thuringiensis, obtained from soil samples

Fabián Galvis1/*+, Laura Yolima Moreno**+

*Dirección para correspondencia:

Resumen

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva formadora de esporas, que produce cristales parasporales de naturaleza proteica, tóxicos contra diferentes órdenes de insectos y biodegradables  e  inocuos  para  otras  especies. Esta investigación empleó el modelo experimental, que mediante técnicas de observación permitió, la identificación microbiológica y bioquímica de B. thuringiensis a partir de muestras de suelo de  los  municipios  de  Cúcuta,  El  Zulia,  Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, y su posterior caracterización con los marcadores moleculares Bc-Rep y MB1. Se identificaron microbiológica y bioquímicamente  10  aislados  como  B. thuringiensis; los resultados del análisis filogenético mostraron diferencias significativas en los agrupamientos obtenidos con los marcadores Bc-Rep y MB1. Con Bc-Rep se registró un índice de similaridad bajo (18%), mientras que con el marcador MB1 se obtuvo un índice mayor de similitud, 58%. En este trabajo se evidenció una gran variabilidad genética entre los aislados, que mostraron a los marcadores Bc-Rep y MB1 como altamente efectivos  para  diferenciar  cepas  estrechamente relacionadas, convirtiéndose en una herramienta genética de gran valor para estudios de identificación y diversidad en B. thuringiensis.

Palabras clave: B. thuringiensis, bioinsecticida, rep-PCR, análisis filogenético.

Abstract

Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacteria forming spores, which produces parasporal crystals of a proteic nature, toxic against various  orders  of  insects  and  biodegradable and  harmless to other species. This research use the experimental model, allowing, through observation techniques, microbiological and biochemical identification of B thuringiensis from soil samples from municipalities of Cúcuta, El  Zulia, Los Patios, San Cayetano and Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia, and its subsequent characterization with molecular markers Bc-Rep and MB1. Microbiological and biochemical tests identified 10 isolates as B. thuringiensis; the results of phylogenetic analysis showed significant differences in the clusters obtained with Bc-Rep and MB1 markers. With Bc-Rep a low index of similarity (18%) was recorded, while with the marker MB1 a higher similarity index, 58%, was obtained. This work indicated a great genetic variability among isolates, showing that markers Bc-Rep and MB1 are highly effective to differentiate closely related strains, thus becoming a genetic tool of great value for studies of identification and diversity in B. thuringiensis.

Keywords: B. thuringiensis, bioinsecticide, rep-PCR, phylogenetic analysis.


Introducción

El empleo de insecticidas químicos ha permitido disminuir de forma rápida y eficiente los problemas causados por insectos que actúan como vectores de enfermedades o como plagas en cultivos agrícolas. Sin embargo el uso irracional y excesivo de químicos genera problemas como la contaminación del ambiente, la pérdida de efectividad de los insecticidas y la reducción de la biodiversidad, entre otros (Bernal 2011).

Bacillus thuringiensis es el insecticida más utilizado para el control de insectos, ya que ha representado aproximadamente el 90% del mercado de biopesticidas, el cual asciende a 600 millones de dólares. B. thuringiensis tiene diversas ventajas que se derivan principalmente de su alta especificidad contra los insectos susceptibles, su inocuidad hacia el medio ambiente, la entomofauna benéfica y demás organismos vivos, incluyendo el hombre, además de una incidencia escasa de fenómenos de resistencia (López y Cerón 2010).

B. thuringiensis es una bacteria Gram-positiva  formadora  de  esporas  que  produce una proteína cristal insecticida, compuesta por delta-endotoxinas que son tóxicas para un alto número  de  insectos  plaga  y son  biodegradables  e  inocuas  para  otras  especies  (Ramírez et ál. 2010). La resistencia presentada por los insectos y la poca persistencia de los biopreparados en el suelo por su escasa adaptabilidad al medio, sugieren la realización de investigaciones que permitan la identificación de nuevos aislados nativos con mayor toxicidad y mayor permanencia en el campo.

Para la producción de biopreparados se recomienda seguir un control de calidad aplicando los parámetros de identidad, concentración y pureza; la identificación especifica del microorganismo permitirá la reproducción de los resultados y evitaría la diseminación en el ambiente de patógenos estrictos u oportunistas del hombre y otros organismos. Para la identificación de B. thuringiensis se siguen procedimientos simples como la descripción de su morfología celular, coloración Gram, análisis de su capacidad para crecer en condiciones aerobias o anaerobias y requerimientos de sustratos especiales para su cultivo. La serotipificación es la técnica más aceptada para la clasificación de subespecies de B. thurigiensis. Estas técnicas permiten una identificación hasta la especie, pero la clasificación de subespecies, serovariedades o cepas, requiere de métodos más específicos, como el uso de marcadores moleculares.

Las  técnicas  de  tipificación  basadas  en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se fundamentan en la amplificación de secuencias de ADN polimórficas y la separación por electroforesis de los productos de amplificación. Estas técnicas poseen un elevado poder de dis- criminación, son menos laboriosas, más rápidas y más flexibles que las pruebas tradicionales de identificación. La técnica rep-PCR nos permite caracterizar subespecies, serovariedades y cepas de una forma más simple, rápida y reproducible en una gran variedad de microorganismos, incluido B. thuringiensis (Lupski y Weinstock 1992).

Esta investigación consistió en la caracterización molecular mediante rep-PCR de 10 aislados nativos identificados inicialmente con pruebas microbiológicas y bioquímicas, a partir de muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander, Colombia.

Materiales y Métodos

Aislamiento e identificación. Se tomaron muestras de 200 g de suelo de pastizales y rizosferas de árboles, a una profundidad de 5 a 10 cm, provenientes de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. De cada muestra se registró in situ, la localización y las características físicas del sitio de muestreo; y ex situ, se determinó el pH y la textura del suelo. Las muestras fueron secadas a temperatura ambiente (24ºC) durante un día. Para el aislamiento de B. thuringiensis se utilizó el método descrito por Galvis (2013); la determinación macroscópica y microscópica se hizo con la descripción propuesta por Realpe et ál. (2002); y la identificación bioquímica  se  realizó  con  el  kit  BBL  CRYS- TAL  Gram  Positivo/GP  (Becton  Dickinson)  y los parámetros presentados por Dworkin et ál. (2006). Como controles positivos para las pruebas bioquímicas y moleculares se utilizaron variedades de B. thuringiensis donadas por Corpoica Tibaitata y la Corporación para la Investigaciones Biológicas (CIB): aizawai, darmstadiensis, kenya, tenebrionis, sandiego, israelensis.

Caracterización molecular mediante rep-PCR. El ADN de los aislados y las cepas control se obtuvo por medio del kit Wizard Genomic DNA Purification de Promega. Los marcadores  y  cebadores  utilizados  fueron  Bc-Rep-1 (5’-ATTAAAGTTTCACTTTAT-3’), Bc-Rep-2 (5’-TTTAATCAGTGGGG-3’)  (Bartoszewicz  et ál. 2013) y M-B1 (5’-TGTACATAAGACGAA- GCCC-3’) (Brumlik et ál. 2001). Las muestras de  ADN  fueron  amplificadas  en  un  volumen final de 50 μl con 200 μM de dNTPs, 2U de Taq Polimerasa, 5 mM de MgCl2, 1 μM de cada oligonucleótido y 2 μl del ADN aislado. Los ciclos de amplificación usados para la rep-PCR fueron: desnaturalización inicial a 94ºC por 5 min, seguidos de 32 ciclos de 94ºC por 1 min, 42ºC por 1 min, y 72ºC por 1 min y 30 s; y una extensión final de 72ºC por 7 min. Los perfiles de bandas se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1,4% por 3 h a 50 V, y teñidos con bromuro de etidio. Los perfiles de ADN fueron analizados con el software estadístico NTSYS 2.0.

Resultados y Discusión

Aislamiento  e  identificación.  Se  recolectaron 45 muestras de suelo de los municipios de Cúcuta, El Zulia, Los Patios, San Cayetano y Villa del Rosario, Norte de Santander. Los suelos muestreados fueron de textura predominante arcillosos–arenosos y con un rango de pH entre 4,5 y 9,7. Se seleccionaron 10 aislados por presentar las siguientes características: 1. Morfología predominante para B. thuringiensis (colonia mediana a grande, plana de borde irregular lobulado y/o arborescente, consistencia blanda, aspecto opaco/ mate, pigmentación blanco cremoso) 2. Bacilos Gram positivos. 3. Esporas cilíndricas u ovoides no deformante del cuerpo del bacilo en posición terminal o subterminal. 4. Y por presentar cristal.

Los 10 aislados se identificaron como B. cereus con BBL CRYSTAL, y debido a que B. cereus  y  B. thuringiensis  son  bioquímicamente idénticos, diferenciándose únicamente por la producción  del  cristal  parasporal,  se  confirma que estos aislados pertenecen a esta especie. En la caracterización bioquímica a nivel de variedad de B. thuringiensis, los aislados BtNS2, BtNS4, BtNS6, BtNS7, BtNS9 y BtNS10 poseen un 100% de similitud bioquímica con B. thuringiensis var. Kurstaki; el aislado BtNS8 mostró relación con B. thuringiensis, var. Israelensis; y los aislados BtNS1 y BtNS3 no presentan relación con las variedades comparadas.

Caracterización molecular. Las amplificaciones con el marcador Bc-Rep mostraron patrones con pocas bandas que variaron en número de 1 a 5, con un tamaño aproximado entre 4000 y 400 pb. (Figura 1). Las bandas ubicadas a 1700 y 1100 pb presentan mayor similitud entre los aislados, pero están ausentes en algunos de ellos, por esta razón también se consideran polimórficas.

Los patrones observados en la amplificación con el marcador MB1 presentaron mayor cantidad  de  bandas  que  los  obtenidos  con  los cebadores Bc-Rep. El número de bandas amplificadas en los diferentes aislados y controles varió entre 4 y 12 y con un tamaño aproximado de 2500 a 150 pb. (Figura 2). Todos los aislados, menos BtNS1 y BtNS2, comparten una banda de 1400 pb, que también está presente en los controles B. thuringiensis var. Tenebrionis, B. thuringiensis var. Berliner, B. thuringiensis var. San diego y B. thuringiensis var. Israelensis. Las bandas de 1000 y 500 pb están presentes en todos los aislados menos en el BtNS1.

Análisis filogenético. El análisis con el marcador Bc-Rep generó 4 clusters, donde los clusters I, II y III se agrupan con una similitud de 18%. El aislado BtNS7 no tiene ninguna similitud con todos los demás aislados y controles. En el cluster I los aislados BtNS4, BtNS5, BtNS6 y el control B. thuringiensis var. Darmstadiensis com- parten un 100% de similitud. En el cluster II los aislados BtNS1 y BtNS2 tienen una similaridad de 80%. Los controles B. thuringiensis var. Tenebrionis y B. thuringiensis var. Berliner presentan un 86% de similitud; y un 54% de similaridad con los aislados BtNS1, BtNS2 y BtNS3. El clus- ter III agrupa los aislados BtNS9 y BtNS11 con una similitud del 100%, y estos 2 comparten un 73% de similitud con el control B. thuringiensis var. San diego (Figura 3).

El análisis filogenético para los aislados nativos y controles con el marcador MB1 gene- ró 4 clusters. Todos los aislados presentan una similaridad de 58%. En el cluster I el aislado BtNS6 y el control B. thuringiensis var. Aizawai comparten un 72% de similaridad. En el cluster II se agrupan 10 muestras con un coeficiente de similitud del 77%. Los aislados BtNS1 y BtNS8 comparten una similaridad de 97% entre sí, y un 89 y 87% con los controles B. thuringiensis var. Berliner y B. thuringiensis var. San diego, respectivamente. Los aislados BtNS4 y BtNS5 tienen un 100% de similitud, y los 2 comparten un 94% con el aislado BtNS3. En el cluster III los aislados BtNS9 y BtNS11 comparten 100% de similitud; y estos 2 con B. thuringiensis var. Israelensis tienen un 82% de similaridad. En el cluster IV solo se encuentra el aislado BtNS10 que comparte un 71% de similitud con los clus- ters II y III. (Figura 4).

La rep-PCR es una técnica útil para estudios de variabilidad genética en aislados de B. thuringiensis provenientes de diversas fuentes, que ofrecen múltiples ventajas como la universalidad de los cebadores, reproducibilidad relativa de los resultados, y sencillez en su procedimiento y equipos requeridos (Katara et ál. 2012).

En este trabajo la rep-PCR mostró clara- mente distintos patrones de amplificación para todas las cepas, con pocas bandas comunes entre algunos aislados y controles. El análisis filogenético con Bc-Rep mostró un índice de similaridad bajo (18%), debido posiblemente a la alta variabilidad genética dentro de este grupo, detectada por este marcador, de allí su posibilidad de adaptarse a diferentes ambientes y presentar efectos tóxicos hacia varios ordenes de insectos. Lo anterior también ha sido reportado por diversos autores, al observar un alto grado de polimorfismos entre diferentes aislados de B. thuringiensis inclusive, provenientes  de  un  mismo  sitio  (Katara  et  ál. 2012). En un estudio realizado por Reyes e Ibarra (2005), donde caracterizaron diferentes variedades de B. thuringiensis mediante rep-PCR con el marcador Bc-Rep, obtuvieron una similitud de 12% entre las variedades israelensis y aizawai de B. thuringiensis. Este porcentaje de similitud es semejante al obtenido en este trabajo, 18%, a partir de los mismos cebadores y entre las mismas variedades de B. thuringiensis.

El marcador MB1 permitió mayor con- fiabilidad  en  el  agrupamiento  de  los  aislados, y generó una similitud del 58%. Brumlik et ál. (2004) también utilizaron MB1 para caracterizar diferentes especies del grupo de B. cereus (B. cereus, B. anthracis y B. thuringiensis) y obtuvieron un coeficiente de similitud entre todos los aislado del 30%. En este trabajo el porcentaje de similitud con MB1 fue mayor, 58%, debido a que solo fueron caracterizados aislados de B. thuringiensis, identificados bioquímicamente.

Finalmente este trabajo mostró que la mayoría de los aislados presentaron diferentes patrones de bandas a pesar de haber sido aislados en la misma región, lo que demuestra la gran variabilidad genética de B. thuringiensis y el alto poder de discriminación que poseen los marcadores Bc-Rep y MB1, que permiten establecer diferencias  a  nivel  interespecifico.  A  pesar  de esta variabilidad genética, presentada entre los aislados de B. thuringiensis, se observó que tanto el marcador Bc-Rep como MB1, permitieron el agrupamiento de los aislados BtNS4 y BtNS5 con el control B. thuringiensis var. Darmstadiensis. Estos aislados podrían ser analizados mediante bioensayos o caracterización de genes cry y cyt, para probar su potencial como bioinsecticidas contra dípteros.


Literatura Citada

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*Correspondencia:
Correo  electrónico: he.galvis@mail.udes.edu.co
*Grupo  de  Investigación  Biogen,  Universidad  de Santander, Cúcuta, Norte de Santander, Colombia. Autor  para  correspondencia. 
**Grupo de Investigación Majumba, Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Norte de Santander, Colombia.

Recibido: 02/05/13                Aceptado: 10/09/13