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Agronomía Costarricense

Print version ISSN 0377-9424

Agron. Costarricense vol.37 n.1 San Pedro de Montes de Oca Jan./Jun. 2013

 

Resistencia genética de híbridos de tomate (Solanum lycopersicum L. (Mill.) Al virus del bronceado (TSWV)

Genetic resistance of tomato hybrids (Solanum lycopersicum L. (Mill.) to tomato spotted wilt virus (TSWV)


Julio Gabriel1/*+, Daniel Sanabria**+, Silene Veramendi*, Giovanna Plata*, Ada Angulo*, Mario Crespo*


*Dirección para correspondencia:

Resumen    
 
La presente investigación se realizó en el invernadero y laboratorio de la Fundación PROINPA en Cochabamba - Bolivia en el 2012. El objetivo fue evaluar la resistencia y suscep-tibilidad de plantas a los virus Tomato spotted wilt virus – TSWV, Tomato cholorotic spot virus – TCSV y Groundnut ringspot virus – GRSV en 10 híbridos de tomate mediante evaluación feno-típica y del patrón molecular (marcador SCAR Sw- 421), que distingue los homocigotos y hete-rocigotos resistentes del susceptible. Los resul-tados mostraron que el marcador SW-421 se co-localizó con el gen Sw-5 de resistencia a TSWV. Se observó la presencia de la banda de resistencia (R) para TSWV a 940 bp en las variedades PROINPA 2 (Aguaí) y PROINPA 9 (Bonita) en estado homocigoto dominante (Sw-5/Sw-5). Las variedades PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka), y PROINPA 10 (Bola Pera), mostraron la banda resistencia (H) a TSWV a 900-940 bp en estado heterocigoto (Sw-5/Sw-5+). Solamente la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING SW-5 y la variedad Shannon mostraron el gen de suscep-tibilidad (S) al TSWV a 900 bp en estado homo-cigoto recesivo (Sw-5+/Sw-5+). Los análisis de severidad y de DAS-ELISA fueron confirmados con el análisis molecular.

Palabras clave: DAS-ELISA, severidad, homocigosis, heterocigosis, susceptibilidad, alelo.

Abstract
This research was conducted at the PROINPA Foundation’s greenhouse and laboratory in Cochabamba, Bolivia in 2012. Its objective was to evaluate the resistance and susceptibility to Tomato spotted wilt virus – TSWV, Tomato cholorotic spot virus – TCSV and Groundnut ringspot virus – GRSV in 10 tomato hybrids. Phenotypic and molecular pattern (SCAR marker SW-421) evaluations were performed in order to differentiate homozygous and heterozygous resistant from susceptible plants. Results showed that molecular marker Sw421 is co -located with the TSWV-resistance Sw-5 gene. A TSWV-resistance band (R) was observed at 940 bp and showed the homozygous presence of the Sw-5 allele (Sw-5/Sw-5) in PROINPA 2 (Aguai) and PROINPA 9 (Bonita) varieties. PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka) and PROINPA 10 (Bola Pera) varieties, showed a TSWV resistance band (H) at 900-940 bp in the heterozygous state (Sw-5/Sw-5+). Only PROINPA 7 (Redonda), the male parent 71 LACHING 89S Sw-5 and the variety Shannon showed TSWV susceptibility gene (S) at 900 bp in the homozygous-recessive state (Sw-5+/Sw-5+). The results of the severity analysis and of DAS-ELISA were confirmed by the molecular analysis.

Keywords: DAS-ELISA, severity, homozygous, heterozygous, susceptibility, allele.

Introducción

Las enfermedades causadas por virus son consideradas un obstáculo para el cultivo del tomate [(Solanum lycopersicum L. (Mill,)] ya que causan pérdidas significativas en la producción. En Bolivia, como lo indica una reciente investigación (Plata 2011) el Tomato spotted wilt virus – TSWV, el Tomato cholorotic spot virus – TCSV y el Groundnut rigspod virus – GRSV son los más importantes virus causantes del Tospovirus (virus del bronceado o peste negra), y confirma lo ya indicado por Abad (2005). Similar situación se ha reportado en otros países como Brasil, donde además tienen al Crysanthemum stem necrosis virus – CSNV que afecta al tomate (Lima et ál. 2002, Ferraz et ál. 2004, Lau et ál. 2006).

Se debe mencionar que la resistencia genética del tomate al virus TSWV se ha visto en distintas accesiones en el género Lycopersicum (García y Lozoya 2004, Robertson y Labato 2007). Algunos alelos de resistencia se introdujeron en cultivares comerciales, como el Rey de los Tempranos que tiene resistencia de Lycopersicum esculentum y Stevens que tiene resistencia de L. peruvianum. Estos cultivares son las 2 principales fuentes de resistencia utilizadas en el control genético del TSWV en los programas de mejoramiento en Brasil y otros países (Ferraz 2004, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). La resistencia en el cultivar Stevens es controlado por un gen, denominado Sw-5 con interacción alélica dominante (Rosello et ál. 1998, Stevens et ál. 1992, Juliatti y Maluf 1995), mientras que para el cultivar Rey de los Tempranos la resistencia es controlada por al menos 1 a 3 genes con interacción semi-alélica dominante (Juliatti y Maluf 2005, Erico et ál. 2009).

Se atribuyeron muchas ventajas a la selección asistida por marcadores moleculares (SAMM) (Moon y Nicholson 2007, Foolad 2007) como efecto de la ausencia del efecto medio ambiental y la independencia del desarrollo de la planta, que es considerado por algunos autores como uno de los principales problemas en la selección de resistencia o de plantas inmunes a los virus a través de la selección fenotípica (Lanza et ál. 2000, Ribeiro et ál. 2006).

Referente a la resistencia al virus es posible piramidar múltiples alelos de resistencia. En el caso de TSWV, el marcador SCAR SW- 421 podría ser una herramienta importante para la SAMM. Varios marcadores moleculares asociados al gene-virus de resistencia se han identificado, aunque su uso no ha sido frecuente cuando no están estrechamente asociadas al gen con un alelo interés (Silva et ál. 2003, Santos 2004, Ribeiro et ál. 2006). La distancia entre el Sw-421 y el alelo marcador Sw-5 es menor que 1,0 cM (Stevens et ál. 1991), y esto permite la selección de la Sw-5 alelo con un buen margen de seguridad.

Stevens et ál. (1995) desarrollaron el marcador UBC-421 de un RAPD (Random amplified polymorphic DNA) que es un iniciador (primer en inglés) decámero (ACG GCC CAC C), el cual mostró una banda a 940 bp (banda 421R) en genotipos resistentes y una banda a 900 bp (banda 421S) en los materiales susceptibles a una pequeña distancia de 1,0 cM del gen Sw-5 con una banda polimórfica de tipo co-dominante; es decir, 2 bandas en los genotipos supuestamente heterocigotos (Stevens et ál. 1996). El marcador UBC-421 fue posteriormente convertido en un marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) tipo co-dominante (iniciadores Sw-421-1 y 421-2 a 20 bp), un trabajo reciente realizado por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009), confirmó la herencia co-dominante del marcador Sw-421 al identificar genotipos resistentes de tomate en progenies isogénicas segregantes. Como Sw-421 muchos otros marcadores moleculares tipo SCAR fueron desarrollados, pero su eficacia aún necesita ser probada en los programas de mejoramiento genético de tomate (Moon y Nicholson 2007, Fooland 2007, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). Convertir marcadores específicos RAPD en marcadores para PCR (Polimeraza Chain Reaction) es deseable porque los marcadores basados en PCR son de fácil uso, menos laboriosos y de bajo costo para ensayar un locus simple y que es más reproducible (Moon 2006, Stevens y Robbins 2007).

El objetivo del presente estudio fue evaluar la resistencia y susceptibilidad de plantas en híbridos de tomate por evaluación fenotípica y del patrón molecular a través del marcador SCAR (Sw-421), que distingue los homocigotos (Sw-5/ Sw-5) y heterocigotos (Sw-5/Sw-5+) resistentes del susceptible (Sw-5+/ Sw-5+).

Materiales y Métodos

El estudio se realizó en la campaña 2012 en el invernadero y laboratorio de biología molecular de la Fundación PROINPA, zona de El Paso, a 15 km de la ciudad de Cochabamba provincia de Quillacollo del departamento de Cochabamba (Bolivia), comprendido entre los paralelos 17°18’ de latitud Sur y 66°14’ de longitud Oeste, a una altitud de 2540 msnm.

Se utilizaron 10 híbridos y 2 parentales de tomate obtenidos en el programa de mejoramiento genético de la Fundación PROINPA (Gabriel et ál. 2012).

QTLs y genes de resistencia conocidos

Se utilizó el marcador Sw-421 que fue compendiado en una lista de marcadores potenciales que están ligados y co-localizados con el gen de resistencia al tospovirus Sw-5 en un mapa referencial de papa y tomate (Tanskley et ál. 1992, Brommonschenkel y Tanksley 1997, Foolad 2007, Moon y Nicholson 2007, Rodrigues do Nascimento et ál. 2009). En el Cuadro 1 se describe el gen de resistencia a TSWV mientras que en el Cuadro 2 los marcadores en los híbridos para el cribado del gen Sw-5 de resistencia a tospovirus (TSWV) en tomate.

Extracción de ADN

Se colectaron foliolos jóvenes y sanos de 10 híbridos y 2 parentales de tomate, provenientes de invernadero y almacenadas a -20ºC.

El ADN genómico total fue extraído a partir del material vegetal molido mediante el método CTAB 2X (hexadecil bromuro de trimetil amonio) desarrollado por Doyle y Doyle (1990). La calidad y concentración del ADN obtenido fue evaluado después de la tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa al 1% y transluminador UV marca Biorad.

Condiciones de la PCR

Para el análisis de PCR se siguió el protocolo desarrollado por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) con algunas modificaciones, donde la mezcla de reacción contenía 15 ng de ADN genómico, buffer PCR 10X, 0,2 mM dNTP, 1 pmol.µl-1 de cada iniciador y 0,025 U.µl-1 de la enzima Tag polimeraza.

Las condiciones de reacción consistieron en 94ºC por 5 min, 35 ciclos de 94ºC por 1 min, 60ºC por 45 s y 72ºC por 60 s. (T100 Thermal Cycler marca BioRad). Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa.

Análisis de alelos

La presencia o ausencia del marcador molecular validado en cada híbrido, se anotó y almacenó en archivos con formato EXCEL para su posterior análisis.

Resistencia en plantas

Se lavaron 10 semillas de cada uno de los híbridos en investigación con solución de Metil-1-(butilcarbamoil)-2-bencimidazol-carbamato (Benomyl) y se las colocó en cámara húmeda esto es, cada semilla en una servilleta empapada con agua y se mantuvo cerrado por 6 días a temperatura ambiente. Luego se realizó la siembra en un semillero y cuando las plantas alcanzaron un tamaño entre 10 a 12 cm en la cuarta semana de la siembra se transplantaron en macetas de 1½ kg con tierra esterilizada humedecida en invernadero. Se fertilizó, regó y controlaron las plagas y enfermedades que podrían afectar a las plantas hasta el momento de la inoculación, mediante un fungicida sistémico con base en Propiconazole y Difenoconazole (Taspa-0,5 cc.l-1) y un insecticida con base en Lambda-cihalotrina (Karate–1 cc.l-1).

Inoculación

Para el experimento se utilizaron 65 plantas sanas de tomate con 90 días de edad distribuidas en 13 sub-grupos de 5 plantas cada una. Para la inoculación del virus se siguió el protocolo recomendado por López et ál. (2003).

Como testigos se utilizaron 6 plantas entre las mismas accesiones, las cuales se trataron únicamente con el abrasivo y el buffer fosfato, y se las mantuvo en otro invernadero durante todo el experimento.

Se realizó la serología a 3 plantas infectadas y con sintomatología en invernadero, y se confirmó un DAS-ELISA positivo (+) para una única planta, las otras 2 presentaron resultado negativo (-). Con base en estos resultados se volvió a extraer el inóculo solo de la planta confirmada y se efectuó una segunda inoculación a los 7 días después la primera inoculación y una tercera inoculación a los 9 días.

Análisis de la severidad

En las plantas inoculadas en invernadero se realizaron evaluaciones de severidad con la escala recomendada por López et ál. (2003) para ubicar las características de severidad de sintomatología producida por TSWV (Cuadro 3).

Análisis serológico por DAS-ELISA

Inoculación

El inoculo, con TSWV previamente identificado por DAS-ELISA, se preparó por maceración de hojas sintomáticas en una dilución de 1/10 (P/V) en tampón fosfato 0,01 M con Sulfito de Na al 0,1% y pH 7,22 con adición final de carburundum. El inoculo se mantuvo en un baño de hielo durante todo el proceso de la inoculación (López et ál. 2003).

Se realizó el análisis serológico en 65 plantas inoculadas con síntomas de TSWV y en 5 plantas testigo, mediante el DAS-ELISA (Double Antibody Sándwich – enzyme linked immunosorbent assay). Se llevo a cabo un análisis serológico para GRSV y TSCV en las mismas plantas. Se utilizaron antisueros de la línea AGDIA.

Se colectaron 2 g de 5 plantas por híbrido, obteniéndose un total de 14 muestras para la prueba.

Para sensibilizar la placa se disolvió 0,146 g de NAHCO3 y 0,079 g de NA2CO3 para 1 l con 0,010 g de NaN3 y finalmente se agregó 100 µl de la gamma globulina purificada y se incubó a 4ºC toda la noche.

Preparación de las muestras para su análisis

Según protocolo del fabricante la muestra se utilizó en relación 1:4 (Cuadro 4). Se utilizó 100 µl de la muestra diluida y testigos (Blanco y control para TSWV).

Se incubó la placa con los antígenos a 4ºC toda la noche, se adicionó el conjugado en dilución 1:200, luego se añadió la enzima-gamma globulina e incubó a 25ºC por 2 h, finalmente el sustrato disuelto en buffer de concentración 0,5 mg.ml-1 se incubó a temperatura ambiente por 30 min. Las lecturas se realizaron a 450 nm en lector de ELISA.

Resultados

Análisis de la resistencia

Los resultados mostraron que los híbridos cuyo padre fue la especie silvestre 70 89R Sw-5/ Sw-5 (Solanum peruvianum) portador del gen Sw-5 en estado homocigoto transfirió exitosamente el gen de resistencia a TSWV (Cuadro 5). Cabe mencionar que tampoco se observaron síntomas típicos de GRSV y TCSV, lo cual se confirmó con la prueba de DAS-ELISA que no detectó la presencia de estos virus (Cuadro 5).


Se observó que el híbrido PROINPA 7 (Platus x 71 89S LACHING Sw-5) mostró un síntoma leve de atrofiamiento en el crecimiento (escala 1) y fue positivo en la prueba de DAS-ELISA con un valor de 0,139 de absorbancia (Cuadro 5), dicho aspecto indica que este híbrido fue susceptible a TSWV. En cambio, el híbrido PROINPA 6 (Martha x 71 89S LACHING Sw-5), no mostró síntomas de severidad a TSWV, y no reaccionó en la prueba de DAS-ELISA, lo que señala que probablemente éste híbrido tiene algún grado de resistencia y el gen está en estado heterocigótico (Sw-5/Sw-5+) (Cuadro 6), pero si mostró reacción al GRSV y TCRV (Cuadro 5), lo que denota que tuvo susceptibilidad a ambos tipos de virus.

Análisis molecular

La temperatura de hibridación (Tm) del iniciador al ADN genómico se realizó en una PCR de gradiente, determinándose una Tm de 60ºC como la más optima y en la cual se logró una mejor amplificación, visualizándose la banda de interés para el marcador Sw-421 a los 940 bp.

El análisis molecular (Figura 1 y Cuadro 6) mostró que las variedades PROINPA 2 (Aguaí), y PROINPA 9 (Bonita) tienen el gen de resistencia (R) a TSWV en estado homocigoto dominante (Sw-5/Sw-5) y se la encontró a los 940 bp. Las variedades PROINPA 1 (Andinita), PROINPA 3 (Arami), PROINPA 4 (Yara), PROINPA 5 (Pintona), PROINPA 6 (Jasuka), PROINPA 8 (Cleopatra) y PROINPA 10 (Bola pera), tienen el gen de resistencia (H) a TSWV en estado heterocigoto (Sw-5/Sw-5+) y se las ubicó entre 900 -940 bp. Solamente en la variedad PROINPA 7 (Redonda), el padre 71 89S LACHING Sw-5 y la variedad Shannon, presentaron el gen de susceptibilidad (S) al TSWV en estado homocigoto recesivo (Sw-5+/ Sw-5+) y se la detectó a 900 bp.

Discusión

El método de ADN con el uso de CTAB, fue eficiente y conveniente para la extracción a partir de pequeñas muestras de tejido (Ferreira y Grattapaglia 1998), lo cual se evidenció por el alto nivel diferenciación en las bandas encontradas con el iniciador utilizado, obteniéndose ADN de buena calidad, libre de contaminantes, libre de ARN, no degradado, y con alto peso molecular. La temperatura de hibridación para la amplificación se ajusto a 60°C, que difiere a los reportados por Nascimento et ál. (2009) y Erico et ál. (2009), lo que es indicativo que se requieren mejoras de los protocolos en cada laboratorio.

Cabe mencionar que investigaciones realizadas por Boiteux y De Giordano (1993) encontraron que el mismo gen de resistencia al TSWV le confiere resistencia a GRSV y TCSV, lo cual nos hace ver la gran importancia de incorporar genes de especies silvestres emparentadas con el tomate. En nuestra investigación los análisis han mostrado que aparentemente se ha logrado el control efectivo de los 3 virus con el gen Sw-5 introducido de Solanum peruvianum en algunos de los híbridos evaluados.

También se identifica que la enfermedad evoluciona y como solución más práctica se identifica la necesidad de buscar y seleccionar nuevas fuentes de material con resistencia natural contra las nuevas variantes de TSWV. En este sentido, esta investigación ha procurado obtener nuevas fuentes de resistencia, mediante inoculación mecánica de aislados virales que superan la resistencia, en entradas de diferentes especies silvestres relacionadas con el tomate cultivado (Peralta et ál. 2007). Así, se recomienda ensayar el uso de accesiones de las especies Solanum habrochaites, S. chilense, S. pennellii, S. peruvianum y S. pimpinellifolium (Peralta et ál. 2007). En el futuro se espera determinar el control genético de estas resistencias para, transferir luego, los genes responsables, a variedades de tomate de interés agronómico.

Por otra parte también se observó que la evaluación fenotípica confirmó la eficiencia en el proceso de inoculación y mostro reacción diferencial de los genotipos de acuerdo con la presencia o ausencia del alelo Sw-5. El marcador molecular permitió la identificación de homocigotos Sw-5/Sw-5 y heterocigotos Sw-5/Sw-5+ en las plantas resistentes, resultados similares a los encontrados por Rodrigues do Nascimento et ál. (2009) al evaluar progenies isogénicas segregantes de tomate.

Agradecimientos

Se agradece al apoyo económico de los proyectos: Fontagro - Desarrollo y valoración de recursos genéticos de Lycopersicon spp., para su utilización en mejoramiento genético de Solanáceas frente a estrés biótico y abiótico (ID: 8071) y “Fortaleciendo capacidades de innovación participativa para luchar contra la pobreza rural” (IP – Holanda).

Literatura Citada

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*Correspondencia a:
Julio Gabriel. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia. Correo electrónico: j.gabriel@proinpa.org
Daniel Sanabria. Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia.
Silene Veramendi. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia.
Giovanna Plata. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia.
Ada Angulo. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia.
Mario Crespo. Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia. Autor para correspondencia.
1. Autor para correspondencia. Correo electrónico: j.gabriel@proinpa.org
* Fundación PROINPA, Casilla 4285, Cochabamba, Bolivia.
** Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón, Cochabamba, Bolivia.

Recibido: 30/08/12 Aceptado: 11/12/12

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