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Revista Costarricense de Ciencias Médicas

Print version ISSN 0253-2948

Rev. costarric. cienc. méd vol.21 n.3-4 San José Dec. 2000

 

La alfa hemolisina de Escherichia coli potencia el metabolismo oxidativo
de neutrófilos humanos en respuesta al péptido quimiotáctico FMLP:
comparación con el ionóforo de calcio A23187.
Jorge García*

Resumen

El aumento en el calcio citoplásmico inducido por el ionóforo de calcio ionomicina en leucocitos polimorfonucleares (PMN) incrementa la producción de superóxido en respuesta a estimulación secundaria con el péptido quimiotáctico FMLP ( Helman Finkel, T. et al. J. Biol. Chem.1987; 262:12589-12596). En esta investigación se estudió el efecto del tratamiento de PMN con alfa hemolisina (AH) o el ionóforo de calcio A23187 (que incrementan el calcio intracelular) en el metabolismo oxidativo de PMN (estimado por medio quimioluminiscencia) en respuesta a la estimulación secundaria con FMLP. Tanto el A23187 como la AH potenciaron la respuesta quimioluminiscente (amplificada con luminol) a estimulación posterior con FMLP, indicando sobreestimulación del metabolismo oxidativo en PMN. Experimentos adicionales, con lucigenina como amplificador de luminiscencia, mostraron que el ionóforo de calcio A23187 potenció la liberación de superóxido, de manera similar a la reportada para la ionomicina, pero que la AH solo causó liberación ínfima de superóxido al espacio extracelular. Los resultados se comentan en referencia a procesos infecciosos causados por cepas hemolíticas de Escherichia coli. (Rev Cost Cienc Med 2000; 21 (3-4):141-159).
 

Palabras clave

Leucocito polimorfonuclear, quimioluminiscencia, luminol, lucigenina, A23187, alfa hemolisina, FMLP.
 

Abstract

The calcium ionophore ionomycin primes polymorphonuclear leukocytes (PMN) for increased superoxide production upon stimulation with the chemotactic peptide FMLP (Helman Finkel, T. et al. J Biol Chem 1987; 262: 12589-12596). In this investigation we assessed the effect of PMN priming with either alpha hemolysin (AH) or the calcium ionophore A23187, both of which increase intracellular calcium, on the oxidative metabolism of PMN (as measured by chemiluminescence) in response to secondary stimulation with FMLP. Both A23187 and AH priming increased the luminol-enhanced chemiluminescence in response to secondary stimulation with FMLP, indicating overstimulation of PMN oxidative metabolism. Additional experiments using lucigenin as chemiluminescence enhancer showed that A23187, but not AH priming of PMN, increased superoxide release in a manner similar to that reported for ionomycin. These results are discussed in reference to infectious processes involving hemolytic E. coli .

Key Words

polymorphonuclear leukocytes, chemiluminescence, luminol, lucigenin, A23187, alpha hemolysin, FMLP.
 

Introducción

Cepas de Escherichia coli causantes de infección urinaria y extraintestinal producen con frecuencia la exotoxina denominada hemolisina alfa (AH) (1), cuyos genes pueden formar parte de una isla de virulencia que codifica también otros factores como resistencia a suero y fimbriación específica, encontrados con más frecuencia en cepas causantes de infección urinaria severa (2- 4). La evidencia experimental señala a la AH como un factor de virulencia. Hasta un 60% de cepas de Escherichia coli aisladas de infecciones extraintestinales son hemolíticas, mientras que cepas de origen intestinal no producen AH con la misma frecuencia (no más de 10-20%). Las cepas hemolíticas son virulentas en modelos animales de infección (5), y además, cepas mutantes no hemolíticas derivadas de cepas salvajes hemolíticas no son virulentas en modelos de peritonitis y pielonefritis, pero su virulencia se restaura al reintegrar los genes de AH a la bacteria (6).

La estructura y el mecanismo de acción de la AH no ha sido esclarecidos totalmente, y son todavía objeto de debate (7-9). Se sabe que la hemolisina es una proteína (107-110 Kd) que se sintetiza como protoxina, y se acila intracelularmente previo a su secreción (10, 11). Posee secuencias repetitivas en su estructura primaria, ricas en glicina, que ligan calcio, y por las que se incluye a la AH en la familia de toxinas denominadas RTX ("Repeat ToXins") (7).

La unión al calcio extracelular es indispensable para la activación de la AH, y causa una transición anfifílica (de hidrofílica a hidrofílica-hidrofóbica), con exposición de residuos hidrofóbicos, como triptofano (12), en la superficie de la molécula, los cuales posibilitan la inserción irreversible de la misma en la membrana de células blanco (13). Tal inserción en la membrana blanco depende de la acilación sufrida por la AH (11,14), que provee puntos de anclaje y facilita interacciones posteriores de la AH en la membrana (15).

Se ha demostrado que la AH forma lesiones en la membrana celular, responsables de ocasionar flujos iónicos de calcio y potasio a través de la misma (16,17). Desde un principio se notó que, en la medida en que la AH causaba entrada de calcio y salida de potasio a la célula, su mecanismo de acción guardaba semejanza con el del ionóforo de calcio A23187 (16). Sin embargo, los efectos de exposición a AH no son idénticos a los de exposición al A23187 (17). Se propuso posteriormente que las lesiones hemolíticas definen poros hidrofílicos con selectividad catiónica (18). El mecanismo de acción de la AH se definió entonces como formación de poros transmembrana, congruente con evidencia obtenida con experimentos de permeabilización de membranas naturales y artificiales por parte de AH (18-20). Sin embargo, hallazgos recientes han puesto en duda la idea del poro transmembrana, ya que el diámetro del mismo parece variar de acuerdo a las condiciones experimentales, y las lesiones causadas por AH parecen agrandarse con el paso del tiempo (21), de manera que permiten la entrada progresiva a la célula de moléculas de mayor peso molecular, y escape de moléculas como ATP (22). Experimentos más recientes (8) se interpretan en el sentido de que la AH es una proteína capaz de insertarse en la membrana, pero ocupando solamente una de las capas fosfolipídicas, lo que, de comprobarse, obligaría a abandonar el modelo del poro transmembrana propuesto con anterioridad. De hecho, las analogías que el mecanismo de acción de la AH tiene con el del ionóforo de calcio A23187 se podrían explicar más adecuadamente con un mecanismo de inserción que no involucre formación de estructuras transmembrana. (23).

La AH es inhibida por proteínas séricas (22, García, J.D., datos no publicados). Por lo tanto, es probable que su radio de acción sea sumamente restringido, y que afecte solo a células físicamente cercanas a la bacteria hemolítica, lo que no siempre se reconoce, ya que algunos autores todavía mantienen la idea de la AH como toxina capaz de actuar a distancia en organismos infectados (24). Los efectos de AH en células blanco van desde ruptura osmótica en eritrocitos (18), toxicidad y activación de la producción de superóxido en células de epitelio renal,(25) hasta degranulación (22), estimulación de metabolismo oxidativo (26), recambio de fosfátidos de inositol de membrana (27), síntesis de leucotrienos y prostaglandinas en PMN (28), y liberación de histamina de leucocitos polimorfonucleares basófilos (28).

Muchos de los efectos que la AH causa en células blanco pueden explicarse como consecuencia del incremento en la concentración del calcio citoplásmico (29). Tal aumento trastorna la homeostasia de la célula, habida cuenta del papel del calcio como segundo mensajero intracelular. El incremento en calcio citoplásmico también ocasiona cambios en el citoesqueleto que conducen a defectos en quimiotaxis. Asimismo, causa degranulación, activación de lipooxigenasas, ciclooxigenasas, y de fosfolipasa A2, lo que acarrea la movilización de ácido araquidónico de la membrana y la producción de eicosanoides como leucotrieno B4 (30). También causa una respuesta quimioluminiscente (QL) en neutrófilos (PMN), indicadora de incremento en metabolismo oxidativo (26,28), que se ha asociado a producción de metabolitos de araquidonato (28), o a la producción de superóxido (31).

Recientemente hemos demostrado que la QL de neutrófilos en respuesta a AH tiene características similares a la causada por el ionóforo de calcio A23187, incluyendo una cinética muy parecida y susceptibilidad a un inhibidor de lipooxigenasa (32). Confirmamos que la QL de PMN en respuesta a AH es, en su mayor parte, una manifestación asociada al metabolismo del ácido araquidónico por la vía de la lipooxigenasa. En este reporte se presenta evidencia señalando que, además de causar QL en PMN, la AH ejerce un efecto sinérgico en la QL en respuesta a la estimulación secundaria de PMN con el péptido bacteriano quimiotáctico FMLP (N-Formil-Metionil-Leucil-Fenilalanina), de manera que la respuesta de QL de PMN expuestos primero a AH y luego a FMLP es considerablemente mayor que la observada en respuesta al FMLP como estimulante único. Dado que los PMN pueden sufrir estimulación múltiple en el sitio de infección, este hallazgo sugiere que el metabolismo oxidativo de los mismos puede sobreestimularse en presencia de bacterias hemolíticas y sus productos.
 

Materiales y Métodos

Cepas de Escherichia coli

Las cepas usadas en esta investigación fueron donadas por el Dr. R.A. Welch (U. of Wisconsin, Madison, WI), y son derivadas de Escherichia coli DH1. La cepa hemolítica WAM 589 se transformó con el plásmido pWAM04, (plásmido pUC 19, en el cual se subclonaron los genes de hemolisina, hly CABD, provenientes del plásmido pSF4000). La cepa control WAM 675 no es hemolítica y fue transformada con el plásmido pUC 19 desprovisto de genes de hemolisina. La cepa control WAM 783 es la DH1 transformada con un derivado del plásmido pWAM04, que posee una deleción en el gen hlyC, el cual codifica la información necesaria para la acilación de la pro HlyA . En consecuencia, WAM 783 secreta una hemolisina no acilada, incapaz de insertarse en membranas de la célula blanco.

Sobrenadanantes de cultivos bacterianos.

Se usaron sobrenadantes crudos de cultivos de la cepa WAM 589 como fuente de hemolisina y sobrenadantes crudos de las cepas WAM 675 y 783 como controles, a diluciones elevadas con respecto a los volúmenes de reacción (más de 1:200).

Las cepas de Escherichia coli se cultivaron en caldo Luria-Bertani (LB), con ampicilina (100 ug/ml) para seleccionar las cepas WAM 589 y 675, y cloramfenicol (20 ug/ml) para seleccionar la cepa WAM 783. Volúmenes de 100 ml de caldo LB se inocularon con 1-3 ml de un cultivo estacionario de la cepa correspondiente ( incubado a 37 °C durante 8-12 horas), luego de lo cual se incubaron a 37C con agitación (200 rpm) en un incubador rotatorio G25 ( New Brunswick, Edison, NJ). Se tomaron muestras de 10-15 ml de los cultivos cuando éstos alcanzaron una densidad óptica (D.O.) de 0,3-0,4 (600 nm) y las bacterias se sedimentaron por centrifugación (7 min., 800 xg) en una centrífuga Sorvall SS1 (Dupont Instruments, Wilmington, DE). El sobrenadante se esterilizó por filtración a través de una membrana estéril con porosidad de 0,4 um (Millipore) , y se mantuvo en hielo previo a su utilización.

Determinación de actividad hemolítica

A cada ml de diluciones dobles seriadas de sobrenadante bacteriano crudo y estéril en solución salina 0,85% con calcio (10 mM CaCl2) se añadió 1 ml de suspensión al 1% de eritrocitos de carnero suspendidos solución salina, y se incubó a 37 °C durante 1 h. Al finalizar la incubación, se añadió a cada dilución 2 ml de solución salina fría; se centrifugó a 700 x g por 5 min. en una centrífuga Sorvall GLC-2B (Dupont Instruments, Wilmington, DE) y se leyó la D.O. del fluido sobrenadante a 545 nm para estimar la liberación de hemoglobina. Se determinó la dilución de sobrenadante que causó 50% de lisis eritrocitaria mediante interpolación en papel semilogarítmico en el cual se había trazado una curva patrón de hemólisis (por lisis hipotónica, en agua destilada) obtenida independientemente con el mismo lote de eritrocitos. El título hemolítico (HU50/ml) se definió como el inverso de la dilución de sobrenadante de cultivo bacteriano que causó 50% de hemólisis. Dado que los ensayos con células se efectuaron en amortigüador HC (descrito a continuación), se hicieron titulaciones de sobrenadantes hemolíticos en el mismo. El título hemolítico no varió con respecto al obtenido en solución salina con calcio.

Obtención de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN).

Se usó sangre venosa heparinizada obtenida de voluntarios sanos, la cual se estratificó en tubos de ensayo sobre medio Mono Poly (ICN-Flow) y se centrifugó de acuerdo a instrucciones del fabricante. Se recogió la banda de PMN y éstos se lavaron usando 20 ml de amortigüador HEPES sin calcio (HNC: HEPES 10 mM, NaCl 144 mM, KCl 5 mM, Glucosa 5,5 mM , gelatina para cultivo de tejidos 0,5% p/v, pH 7,4). Los PMN se resuspendieron luego en solución de NH4Cl (al 0,83% en HEPES 10 mM, pH 7,4) durante 7 minutos a 37 °C, para lisar eritrocitos contaminantes. Los PMN se lavaron una vez más con HNC y se resuspendieron luego en 1 ml de amortigüador (0,8 ml de HNC + 0,2 ml de amortigüador HEPES con calcio, o HC, de composición idéntica a HNC, pero adicionado de 1 mM Ca Cl2 y con 0,1% gelatina, pH 7,4). El conteo de células en la suspensión se efectuó usando una cámara para contar glóbulos (Hemacytometer).

Medición de quimioluminiscencia.

Las mediciones se efectuaron usando un luminómetro de seis canales (Berthold LB 9505C, Berthold Instruments, Wildbad, Alemania) asistido por computadora, y con programas suministrados por el fabricante. El volumen de reacción en las cubetas del luminómetro fue de 500 µL, conteniendo amortiguador (HC o HNC según se indica), 50-100 uL de suspensión celular (0,5 - 1 x 10 6 PMN / mL), 10 – 8 M luminol ( 5-amino-2,3 dihidro-1,4-ftalazinadiona) o lucigenina (Nitrato de bis-N-metilacridinio) como amplificadores de QL. La suspensión celular se mezcló primero con el amplificador (10 uL), y se leyó el nivel basal de QL durante 5-10 minutos. Se registraron diferencias individuales entre los PMN de diferentes donadores respecto de la susceptibilidad a estimulación espontánea del metabolismo oxidativo por parte de luminol o lucigenina. La concentración del amplificador se redujo en caso de activación espontánea de PMN, hasta niveles no estimulantes, y por ello en algunos experimentos varía dentro del rango de 10– 8M. La medición se inició inmediatamente después de la adición de sobrenadante de cultivo bacteriano (1-5 uL) o de otros estimulantes (1-10 uL). Los PMN de diferentes donadores variaron también en su respuesta óptima a estimulantes (la curva de dosis-respuesta a estimulantes tiene forma de campana), lo que se estableció titulando cada lote de PMN previo al experimento, a fin de usar la concentración estimulante óptima en cada experimento. En las conclusiones derivadas de los diferentes experimentos se toman en cuenta esas diferencias, así como las diferencias en las concentraciones de amplificadores. La QL se midió en cuentas por minuto (cpm), y el luminómetro proporcionó un registro continuo de las reacciones. Los valores basales de quimioluminiscencia se restaron de todos los valores experimentales.
 

Resultados

1. Respuestas quimioluminiscentes (amplificadas con luminol, QLLm) de PMN estimulados secuencialmente con ionóforo de calcio A23187 y péptido quimiotáctico FMLP.

El mecanismo de acción de la AH tiene semejanza con el del ionóforo de calcio A23187, ya que los dos aumentan la concentración de calcio intracelular en células blanco. Para estudiar su efecto en la respuesta de QL de PMN amplificada con luminol (QLLm), se procedió primero a estimular secuencialmente PMN con A23187, seguido de FMLP. El luminol es una molécula capaz de penetrar a la célula y por lo tanto detecta radicales intra y extracelulares; es oxidada, con producción de luz, por OCl junto con peróxido de hidrógeno (33), y también por radicales hidroxilo (34), o peroxinitrito, este último proveniente de la reacción entre superóxido y óxido nítrico (35).

El cuadro 1 ilustra los valores máximos de QLLm obtenidos cuando una suspensión de PMN se expuso primero a 0,4 uM de ionóforo de calcio A23187, y luego a diferentes concentraciones de FMLP, en el rango de 0,2 a 1,6 uM. La exposición al A23187 provoca QLLm asociada a la movilización de araquidonato de fosfolípidos de membrana y su ulterior metabolismo por la vía de la lipooxigenasa, liberando radicales hidroxilo, los cuales oxidan al luminol, produciendo luz (34). Luego de que la QLLm descendió a niveles basales, se administró a la suspensión de PMN un nuevo estímulo en forma de FMLP (0,2 a 1,6 uM). Suspensiones de PMN que no fueron tratados con A23187 y que sirvieron como control de la estimulación con FMLP recibieron, respectivamente, 0,4 y 1,6 uM del mismo, y su respuesta quimiluminiscente fue de 60000 y 115300 cpm, respectivamente. Esta respuesta de QLLm a FMLP se debe a la producción de superóxido, que dismuta espontáneamente a peróxido de hidrógeno. La enzima mieloperoxidasa (MPO), liberada de gránulos primarios de PMN durante la degranulación inducida por A23187 (36), convierte al peróxido de hidrógeno en OCl, que junto con peróxido de hidrógeno remanente, oxida al luminol produciendo luz (33).

Sin embargo, los PMN estimulados secuencialmente con A23187 y luego con FMLP mostraron una respuesta de QLLm mayor que la provocada por el FMLP como estimulante único. La potenciación de la respuesta secundaria fue máxima a una concentración de FMLP de 0,8 uM ( que provocó una respuesta 537% mayor que la obtenida con 1,6 uM de FMLP como estimulante único), y disminuyó a concentraciones tanto superiores como inferiores, pero manteniéndose siempre superior a la respuesta a FMLP como estimulante único. Los valores integrales de la QLLm en éste experimento y subsiguientes, que no se ilustran, siguen también la tendencia de los valores máximos ilustrados en el cuadro1.

Experimentos independientes, en los cuales se midió la producción de superóxido (mediante reducción de ferricitocromo c) en PMN estimulados secuencialmente con A23187, seguido de FMLP, mostraron que, en efecto, la cantidad de superóxido liberada luego de la estimulación secundaria fue mayor en un 248 % a la obtenida por estimulación única con FMLP (datos no ilustrados), corroborando así la sobreestimulación en la respuesta de PMN a estimulación secuencial, detectada por luminometría.

2. Respuestas quimiluminiscentes (QLLm) de PMN estimulados secuencialmente con sobrenadante hemolítico y FMLP.

Con el fin de establecer si la AH puede causar efectos similares a los de A23187 en la estimulación secuencial de PMN, se efectuó la serie de experimentos ilustrados en el cuadro 2, los cuales muestran los valores máximos de la respuesta de QLLm en una suspensión de PMN estimulada con sobrenadante hemolítico, seguido de FMLP. Los PMN fueron expuestos a sobrenadante hemolítico, en el rango de dosis de 0,5 a 4 HU50/ml. En consonancia con resultados previos (32), la AH produce una respuesta de QLLm, probablemente debida a la producción de radical hidroxilo durante metabolismo de araquidonato. Dicha respuesta no se observó en PMN expuestos a sobrenadantes no hemolíticos provenientes de las cepas 675 y 783.

La estimulación secundaria de PMN con una dosis única ( 0,2 uM ) de FMLP en PMN pre expuestos a AH provocó una respuesta quimioluminiscente que superó a la causada por FMLP por sí solo. Aunque todas las dosis utilizadas de AH (excepto 4 HU50/ml) causaron sobreestimulación por sobre el valor de QLLm en respuesta a FMLP como estimulante único, el valor máximo de sobreestimulación se detectó en el rango de 0,5-1 HU50/ml. Los PMN expuestos a sobrenadantes no hemolíticos no manifestaron ningún efecto de sobreestimulación al ser expuestos a FMLP, lo que comprueba que los componentes y metabolitos bacterianos contenidos en sobrenadantes no hemolíticos, entre ellos LPS (lipopolisacárido), no causan potenciación de la QLLm.

Resultó sorpresivo que, al medir la producción de superóxido (por reducción del ferricitocromo c) en PMN estimulados secuencialmente con sobrenadante hemolítico y FMLP, la cantidad de superóxido liberado fue igual a la obtenida mediante estimulación única con FMLP (datos no ilustrados).

3. Respuestas de QLLc (quimioluminiscencia amplificada con lucigenina) de suspensiones de PMN estimulados secuencialmente con ionóforo de calcio A23187 y FMLP.

Para establecer la posible participación del superóxido en la QL en respuesta de PMN a FMLP, se repitió la estimulación secuencial con A23187 o AH, seguido de FMLP, pero usando la lucigenina como amplificador de señal quimioluminiscente. La lucigenina es un amplificador de luminiscencia que no penetra a la célula, y por lo tanto detecta radicales extracelulares; muestra especificidad, aunque no de manera absoluta, para reaccionar con anión superóxido. Su empleo ha sido cuestionado en los últimos años, y la controversia al respecto es intensa, con reportes que validan (37) o invalidan (38) su uso como detector específico de superóxido. Sin embargo, la lucigenina, a dosis en rango nanomolar, y en presencia de superóxido dismutasa (SOD, que convierte al superóxido en peróxido de hidrógeno, el cual no produce luz con lucigenina), asegura la especificidad de la detección de superóxido con la lucigenina (39).

Los resultados ilustrados en el cuadro 3 revelan que PMN estimulados con ionóforo de calcio A23187 (0,6 uM) manifiestaron una respuesta de QLLc que es inhibida en un 27% por 25 unidades (U) de SOD y en un 10% por 12 U de SOD; la respuesta no se inhibió en presencia de SOD inactivada por ebullición. Por lo tanto, la mayor parte de esta respuesta quimioluminiscente de lucigenina al A23187 no se debió a la producción de superóxido. Es posible que se deba a su reacción con radicales hidroxilo (39), como parece sugerirlo evidencia reciente, generados durante el metabolismo del araquidonato inducido por A23187 (34).

Una vez que la QLLc en respuesta a A23187 disminuyó a niveles basales, se añadió FMLP (0,4 uM) y se registró la respuesta de QLLc. En PMN pre-expuestos a A23187, la QLLc en respuesta al FMLP es un 437% mayor a la obtenida con el FMLP por sí solo, demostrando que el A23187 potencia la respuesta al FMLP. La QLLc en respuesta al FMLP en estos PMN estimulados secuencialmente (A23187, FMLP) se debe en su mayor parte a la producción de superóxido, como lo demuestra el hecho de que la adición de 25 U de SOD disminuyó la QLLc en un 76%, y la adición de 12 U de SOD la disminuyó en un 59%. La adición de SOD inactivada por ebullición ( 25 y 12 U) disminuyó la QLLc en respuesta a FMLP en un 22-23 %, pero esta inhibición fue causada por ambas concentraciones de SOD inactivada, y por lo tanto no es específica; es probable que se deba al efecto de la SOD, que, como proteína, reacciona con superóxido. Sin embargo, lo anterior indica que la inhibición específica por parte de SOD en este caso es en realidad de 55% para 25 U de SOD y de 36% para 12 U de SOD.

Estos hallazgos son congruentes también con los resultados de la detección de superóxido mediante el método de reducción del ferricitocromo c en PMN estimulados secuencialmente con A23187-FMLP), descritos en la previamente (sección 1 de estos resultados).

4. Respuestas quimioluminiscentes amplificadas con lucigenina (QLLc) en PMN estimulados secuencialmente con sobrenadante hemolítico y FMLP.

Con el fin de investigar el efecto de tratamiento previo con sobrenadante hemolítico en la respuesta de PMN a FMLP, la QLLc se registró primero (cuadro 4) en PMN expuestos a dosis de hemolisina entre 0.5 y 4 HU50/ml. La señal detectada fue débil, con un pico a 2 HU50/ml, y su inhibición por SOD no fue uniforme.

PMN tratados con hemolisina en el rango de 0,5 a 2 HU50/ml manifestaron una respuesta a estimulación secundaria con FMLP ( 6 uM) de hasta un 290% mayor ( a 1,5 HU50/ml) que la de PMN expuestos solamente a FMLP. La sobreestimulación provocada por la estimulación secuencial en PMN se debió en buena parte a la producción de superóxido, ya que la adición de SOD ( 4 U) inhibió la señal en un 75-84%. Debe enfatizarse , sin embargo, que el efecto es de muy poca cuantía, y no fue detectado con el ensayo de reducción de citocromo c para superóxido, probablemente en razón de su menor sensibilidad (datos no ilustrados).
 

Discusión

La producción de radicales libres, y la liberación de contenidos granulares (entre ellos enzimas hidrolíticas) por parte de fagocitos durante procesos inflamatorios, es parte esencial de su actividad en contra de elementos extraños, incluidos microorganismos infectantes. Empero, el precio que tal actividad conlleva es la posibilidad de daño tisular que conduce a cicatrización, ya que los fagocitos activados liberan radicales y enzimas en las cercanías de células sanas, que pueden resultar destruidas junto con los patógenos (40). En modelos de pielonefritis aguda, se ha demostrado que la infiltración de neutrófilos se asocia a destrucción de membrana basal y el epitelio tubular adjunto (41). Por consiguiente, es razonable suponer que aquellos agentes infecciosos que causen la activación de fagocitos, con incremento en metabolismo oxidativo y degranulación, pueden causar daño tisular importante. En efecto, se ha demostrado que cepas de Escherichia coli, aisladas de pacientes que han sufrido de pielonefritis a repetición y muestran cicatrización renal, causan liberación pronunciada de radicales libres derivados del oxígeno cuando son fagocitadas por PMN, y que los radicales se liberan al exterior del fagocito; en contraste con lo anterior, cepas aisladas de pacientes que han sufrido pielonefritis repetidas pero no muestran cicatrización, también causan aumento en el metabolismo oxidativo de PMN, pero en este caso la liberación de radicales libres se da en el compartimiento intracelular los PMN (42). Es evidente entonces que la producción de radicales libres hacia el exterior del fagocito puede tener efectos citotóxicos en tejido circundante.

Trabajos previos han demostrado que la AH estimula el metabolismo oxidativo de PMN (23, 26). Ello sobreviene como consecuencia de los incrementos en calcio intracelular causados por AH, que activan el metabolismo de araquidonato por la vía de la lipooxigenasa y ciclooxigenasa (43), produciendo radicales hidroxilo, responsables de quimioluminiscencia al oxidar al luminol (QLLm). Estos aumentos en calcio intracelular juegan un papel fundamental en variedad de procesos, incluida la activación de la oxidasa de membrana dependiente de NADPH (NADPH oxidasa), responsable de la reducción de oxígeno a superóxido. Existe evidencia previa (44) que señala que PMN expuestos al ionóforo de calcio ionomicina manifiestan producción aumentada de superóxido cuando son estimulados secundariamente con FMLP. Este efecto ha sido atribuido al aumento en calcio intracelular producido por el ionóforo, que, junto con diacilglicerol (proveniente de hidrólisis de fosfolípidos por parte de fosfolipasa C, activada ésta a través de transducción originada en el receptor de FMLP), coadyuva la activación de la NADPH oxidasa junto con la proteína quinasa c (PKC). Además, se ha demostrado que la exposición de fagocitos a AH potencia la respuesta oxidativa en respuesta a estimulación secundaria con acetato de forbol miristato (PMA, un activador directo de PKC), probablemente como consecuencia de los incrementos en calcio intracelular inducidos por AH, que también potencian la acción de PMA en su activación de la NADPH oxidasa (27,31). Teniendo en cuenta lo anterior, en esta investigación se procedió a comparar la estimulación secuencial de PMN con AH o ionóforo de calcio A23187, seguida de FMLP, a fin de indagar el efecto que el incremento en calcio intracelular, inducido por hemolisina o ionóforo (23), tendría en la respuesta quimioluminiscente de PMN a estimulación secundaria con FMLP. Un aumento en la quimioluminiscencia sugeriría potenciación del metabolismo oxidativo en respuesta a FMLP, y si los radicales producidos son extracelulares, significaría que la AH por sí misma tendría el potencial de causar liberación aumentada de radicales, con posibilidad de causar mayor daño al tejido circundante.

Cuando se analizó la respuesta quimioluminiscente de PMN estimulados secuencialmente (A23187-FMLP o AH-FMLP) usando luminol como amplificador de quimioluminiscencia, se obtuvieron resultados similares; tanto A23187 como AH como estimulantes primarios, causaron una respuesta de QLLm, según se ha documentado previamente (32). La estimulación secundaria con FMLP, luego de A23187 o AH, dio como resultado una respuesta considerablemente mayor a la del FMLP como único estimulante. Debido a las diferencias en las concentraciones de estimulantes y amplificadores usadas en los diferentes experimentos, no se hacen comparaciones numéricas, sino de las tendencias observadas en cada serie de experimentos. Queda claro, sin embargo, que la actividad oxidativa de PMN en respuesta a FMLP, medida por la QLLm, es potenciada tanto por A23187 como por AH.

El luminol penetra a los diferentes compartimientos celulares y permite la detección de actividad oxidativa tanto extracelular como intracelular, pero no discrimina entre los diferentes radicales que pueden oxidarlo y producir luz. Se sabe, por evidencia presentada con anterioridad (32,34), que la QLLm en respuesta al A23187 y también a la AH es causada por la producción de radicales hidroxilo generados durante el metabolismo del araquidonato (probablemente por la activación de fosfolipasa A2, lipooxigenasa), debido al incremento en calcio citoplásmico que ocasionan el ionóforo y la hemolisina (43). Cuando los PMN tratados con A23187 reciben luego FMLP, la activación de la NADPH oxidasa (por parte de PKC, activada a su vez por calcio y DAG, generado éste último por fosfolipasa C, o PLC) procede de manera más rápida y sostenida debido probablemente al incremento de calcio intracelular, y también al efecto del araquidonato movilizado previamente por el ionóforo, que activa y potencia a la NADPH oxidasa (45). Como se mencionó en la sección de resultados, la producción aumentada de superóxido se traduce en la aparición de más peróxido de hidrógeno por dismutación espontánea del mismo superóxido. El peróxido de hidrógeno así generado se convierte, por acción de la mieloperoxidasa (MPO, proveniente de la degranulación de PMN inducida por A23187) en OCl, y el luminol es entonces cooxidado por peróxido de hidrógeno y OCl (33). Esta secuencia, que asume producción incrementada de superóxido, fue comprobada por resultados de la medición del mismo (por reducción de ferricitocromo c) en PMN estimulados secuencialmente con A23187-FMLP.

Sin embargo, en PMN estimulados secuencialmente con AH-FMLP, la producción de superóxido es similar a la provocada por el FMLP como estimulante único. Ello implica que la sobreestimulación de QLLm en PMN estimulados con AH-FMLP difiere de la observada en la estimulación A23187-FMLP, y podría deberse a que la AH indujo producción de otra(s) especie(s) reactiva, que oxida al luminol. La evidencia obtenida en esta investigación no fue suficiente para derivar conclusiones en ese sentido. De acuerdo con resultados previos, la sobreestimulación de QLLm causada por AH fue máxima en el rango de actividad hemolítica que causa incrementos en calcio intracelular sin permitir la entrada de moléculas de mayor peso molecular a través de la membrana. (23)

Mediciones adicionales de producción de superóxido mediante la reducción de ferricitocromo c mostraron, además, que los sobrenadantes no hemolíticos de cultivos de Escherichia coli no causaron generación detectable de superóxido, lo que demuestra que el efecto de sobreestimulación es propio de la AH y no de otro componente del sobrenadante de cultivo bacteriano.

En vista de lo anterior, en una segunda serie de experimentos se repitió la estimulación secuencial de PMN (A23187-FMLP, AH-FMLP) utilizando lucigenina, como amplificadora extracelular de QL para la detección de superóxido, ya que el FMLP estimula precisamente la producción de superóxido en PMN (46). La lucigenina posee especificidad relativa para reaccionar con superóxido, lo que se confirma con el uso simultáneo de superóxido dismutasa (SOD). Además, en vista de que la AH por sí sola no estimuló la producción de superóxido en PMN en el ensayo de reducción de ferricitocromo c, se estimó pertinente probar la detección de superóxido mediante luminometría, la cual es una técnica más sensible.

La detección de quimioluminiscencia con lucigenina (QLLc) en PMN estimulados secuencialmente con A23187-FMLP resultó concordante con la quimioluminiscencia de luminol (QLLm). El tratamiento previo de PMN con ionóforo A23187 potenció la respuesta secundaria de QLLc a FMLP, y la inhibición de la señal con SOD confirmó que ésta se debió en su mayor parte a la producción de superóxido por sobreestimulación de la NADPH oxidasa, tal y como lo sugirió la evidencia anterior (44). La estimulación inicial con ionóforo A23187 provocó una respuesta de QLLc en PMN que solo fue parcialmente inhibida (10-27%) por SOD, lo que era de esperarse, porque la respuesta se basa en producción de radical hidroxilo; reportes previos muestran que el tratamiento con ionóforo de calcio, al estimular el metabolismo del araquidonato, promueve también la liberación de superóxido y radical hidroxilo en plaquetas (47). Se podría explicar así, por analogía, la inhibición parcial ejercida por SOD en la señal de QLLc de PMN causada por el ionóforo, pero deja sin esclarecer definitivamente como se origina el resto de esa señal. Al presente, no se dispone de datos experimentales para definir la especie reactiva responsable.

La QLLc en PMN estimulados con AH-FMLP fue de muy poca intensidad, lo que es congruente con que no se haya detectado superóxido al estimular PMN con AH, ni se haya detectado tampoco sobreproducción de superóxido, al estimular ulteriormente con FMLP, en el ensayo de reducción del ferricitocromo c. Como se anotó antes, al ser la luminometría más sensible, podría explicarse así la disparidad. La respuesta de QLLc con AH presentó una inhibición parcial pero variable por parte de SOD, aunque no tanto como la respuesta al FMLP, que sí fue inhibida en su mayor parte por SOD.

En resumen, los resultados obtenidos apuntan a que la AH no solo provoca una respuesta quimioluminiscente en PMN, sino que también potencia la respuesta de QLLm a estimulación secundaria con FMLP. Se concluye también que la potenciación de la respuesta secundaria por parte de AH no se traduce en producción extracelular importante de superóxido. Se puede hipotetizar que la sobreestimulación de la QLLm de PMN expuestos a AH-FMLP podría deberse a la inducción, por parte de AH, de otra especie reactiva que oxide al luminol y que, al no oxidar a la lucigenina, daría cuenta de los resultados obtenidos. Alternativamente, cabe que la AH potencie solo la producción intracelular de radicales, lo que también sería congruente con los datos presentados.

Como la AH es una toxina de muy corto radio de acción, debido a su inactivación por parte de proteínas, no es sorprendente que por sí sola no cause liberación importante de radicales extracelulares. Sin embargo, cuando se expone un fagocito a bacterias hemolíticas, la acción de la AH podría incrementar el metabolismo oxidativo, y la estimulación de receptores adicionales en la membrana del PMN durante la fagocitosis podría resultar en secreción incrementada de radicales libres al exterior, eicosanoides, y enzimas hidrolíticas. En modelos de fagocitosis, tal estimulación múltiple de PMN con zimosán opsonizado y otros estimulantes aumenta la secreción de enzimas de gránulos citoplasmáticos y de eicosanoides. (36). En el caso de bacterias hemolíticas, este fenómeno de sobreestimulación y liberación aumentada de mediadores podría asociarse a la descoordinación y pérdida de efectividad de la fagocitosis (48) y también a alteraciones en el tono y permeabilidad vascular que podrían contribuir al establecimiento y la diseminación bacteriana (28).

Algunos autores han señalado que la AH es un potente inductor de la liberación de superóxido en PMN (31), lo que contrasta con los resultados de este estudio. Sin embargo, la preparación de AH usada en esos experimentos fue depletada de su contenido de lipopolisacárido (LPS), lo que no se hizo en este estudio, y por consiguiente, los resultados no son comparables. Se sabe que la AH forma complejos con LPS cuando se produce en cultivos bacterianos (1). Cabe la posibilidad de que la depleción de LPS module su acción, y sea responsable de efectos que no se observan en AH no procesada para disminuir su contenido de LPS. La idea es sumamente interesante, y ha sido planteada con anterioridad (7).
 

CUADRO 1
Respuestas máximas de quimioluminiscencia de luminol
(QLLM) en PMN estimulados con A23187-FMLP1
 
 
Primer estimulante
Segundo estimulante
A231872
QLLm3
FMLP2
QLLm3
0,4
154 225
1,6
557 700
"
"
0,8
619 700
"
"
0,4
575 000
"
"
0,2 
506 100
--
--
1,6
115 300
--
--
0,4
60 000
 
1 Se ilustran los resultados de un experimento, representativo de seis que proporcionaron tendencias similares. Concentración de luminol 4,5 x 10 – 8 M
2Concentración micromolar
3cpm
CUADRO 2
Respuestas máximas de quimioluminiscencia de luminol
(QLLM) de PMN estimulados con AH-FMLP1
Primer estimulante
Segundo estimulante
AH2
QLLm3
ES4
FMLP5
QLLm3
ES4
-- 
655
40
0,2
21 154 
3 507
0,5
1 700
117
"
112 081
9 201
1,0
8 212
461
"
171 820
27 807
1,5
22 228
1 065
"
78 191
4 162
2,0
16 748
1 396
"
49 464
5 029
4,0
2 215
215
"
4 859
504
7836
491
 
"
19 250
 
6756
704
 
"
17 346
 
1Se ilustran datos de 5-8 experimentos independientes.
Concentración de luminol: 4,5 x 10 – 8 M.
2HU 50 / ml
3cpm
4Error standard
5Concentración micromolar
6Sobrenadantes no hemolíticos en volumen equivalente a 2 HU50/ml. Se ilustra el promedio de dos experimentos
CUADRO 3
Respuestas máximas de quimioluminiscencia de lucigenina
(QLLc) en PMN estimulados con A23187- FMLP1: efecto de SOD2
 
 
Primer estimulante
Segundo estimulante 
SOD2
SODH3
A231874
QLLm5
FMLP4
QLLm5
---
---
---
804
7 517
---
---
0,6
5 152
"
32 873
25
---
"
3 773
"
7 654
12
---
"
4 625
"
13 636
---
25
"
5 527
"
25 740
---
12
"
6 652
"
25 446
1Se ilustra el promedio de dos experimentos, representativos de 7 que muestran tendencias similares. Concentración de lucigenina: 4,5 x 10 – 8 M.
2 , 3 Superóxido dismutasa ( UI ) , o superóxido dismutasa hervida.
4Concentración micromolar.
5cpm
CUADRO 4
Respuestas máximas de quimioluminiscencia de lucigenina (QLLc) en PMN estimulados con AH- FMLP1: efecto de SOD2.
Primer estimulante
Segundo estimulante
AH3
QLLc4
QLLc4 + SOD2
FMLP5
QLLc4
QLLc4 + SOD2
0,0
497
345
6
1 961
910
0,5
418
167
"
3 591
598
1,0
843
714
"
4 539
1 176
1,5
948
446
"
5 761
1 128
2,0
1 265
764
"
3 102
759
4,0
717
832
"
1 233 
756
 
1Se ilustran los resultados de un experimento, representativo de tres que mostraron tendencias similares. Concentración de lucigenina: 1 x 10 – 8 M
2Superóxido dismutasa ( 4 UI )
3HU50 / ml
4cpm
5Concentración micromolar.
 

Referencias

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* Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina
Universidad de Costa Rica