Frecuencias génicas de 10 sistemas isoenzimáticos y su poder de discriminación en la población de Costa Rica        Erna Meléndez ¹,  Ingrid Sanóu¹  

Resumen

Se analizó una muestra de 555 individuos adultos no emparentados, provenientes de diferentes áreas del territorio costarricense mediante el análisis electroforético, se obtuvieron las frecuencias fenotípicas y génicas de 10 sistemas isoenzimáticos polimórficos (PGM sub, EsD, AK, EAP, Glol, ADA, CA lI, PepA, Gc y Tf). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las frecuencias esperadas y las observadas, de acuerdo a la ley de Hardy Weimberg. Los resultados de Glo I, EsD y EAP son comparables a los encontrados en poblaciones caucásicas norteamericanas y AK con poblaciones hispánicas norteamericanas.

Por medio del cálculo del poder de discriminación, se valoró su utilidad en el campo forense como marcadores de individualidad. El poder de discriminación con valores superiores a .34 encontrado en la EsD, Glo I, PGM sub, EAP y Gc indica que éstos marcadores son una herramienta probabilística útil para la Administración de Justicia, en donde la sangre u otro fluido corporal son un indicio.

Palabras clave

lsoenzimas, Fosfoglucomutasa, Esterasa D, Adenilato quinasa, Fosfatasa Acida Eritrocitaria, Glioxilasa 1, Adenosideaminasa, Anhidrasa Carbónica lI, Peptidasa A, Transferrina, Componente Grupo Específico, Poder de Discriminación.
 

Abstract
 
555 blood samples from different areas of the Costa Rican territory was studied by electrophoretic analysis to determine the phenotypic and genotypic frequencies of 10 polymorphic allozimes (PGM sub, EsD, AK, EAP, Glol, ADA, CA II, PepA, Gc y Tf). There are no significant differences between the expected distribution and the ones found according to the Hardy-Weimberg Law.

The results are comparable with other population studies that include North American Caucasian and Hispanic populations. The calculation of the discrimination power is useful in forensic science and the values obtained in EsD, Glo I, PGM sub EAP and Gc make these markers an useful probabilistic tool in the Administration of Justice.
 

Introducción

Las izosimas o isoenzimas son convenientemente definidas como formas moleculares múltiples de una enzima dada que actúan sobre el mismo sustrato y catalizan la misma reacción, se pueden presentar en un mismo individuo o en diferentes miembros de una misma especie y algunas de ellas se han definido como marcadores genéticos porque los genes para una isoenzima particular están estrechamente relacionados a un locus genético y la variación en la población es una indicación de una simple variación genética Mendeliana (1). El mayor objetivo del uso de marcadores genéticos en sangre o fluidos corporales en investigaciones médico-legales, es simplemente establecer la identidad o no identidad entre muestras analizadas y comparadas (2).

Se define poder de discriminación como la probabilidad de que dos individuos escogidos al azar presenten formas isoenzimáticas diferentes en un sistema dado. Mediante electroforesis, se logra la separación e identificación de las formas isoenzimáticas presentes en una persona o muestra y de esta forma se establecen las frecuencias genotípicas y fenotípicas de cada una de ellas en la población.(2)

Algunas isoenzimas se han utilizado ampliamente en las investigaciones forenses o médico legales por presentar mucha variabilidad entre las personas, mantener su expresión a lo largo de la vida, ser estables si se almacenan adecuadamente, ser de herencia codominante, su determinación se realiza por procedimientos simples que consumen poca muestra e idealmente el genotipo se puede inferir directamente del fenotipo.(3).

Las isoenzimas eritrocitarias más utilizadas en la investigación forense son: subtipeo de la Fosfoglucomutasa (PGMsub), Adenilato Quinasa (AK), Fosfatasa Acida Eritrocitaria (EAP), Glioxilasa (GLO), Esterasa D (EsD), Adenosindeaminasa (ADA), Anhidrasa carbónico (CA), Peptidasa A (PepA). También tenemos los llamados sistemas de grupo séricos donde se incluyen el Componente Grupo Específico (Gc) y Transferrina (Tf) (3).

Por tratarse de marcadores genéticos además de su uso en casos penales, también pueden utilizarse en investigaciones de paternidad (4).

En nuestro país la determinación rutinaria de marcadores isoenzimáticos en ciencias forenses se dio al inicio de los años 90's, pero al carecer de estudios poblacionales, únicamente se emitieron dictámenes con criterios excluyentes o no excluyentes carentes de datos estadísticos.
 
 
Materiales y métodos

Se analizan 555 muestras de sangre pertenecientes a individuos de la población general de Costa Rica, adultos no emparentados, provenientes de diferentes zonas del país que acudieron a los laboratorios forenses por diferentes motivos.

Se prepararon manchas de suero y de sangre en cuadros de tela de algodón prelavados, utilizando suero y 1 ml. de sangre total. Se rotularon adecuadamente y se secaron a temperatura ambiente para luego mantenerlas a -20°C (Congelador Seco lsotemp Fisher Scientific).

De las manchas se corta un trozo de tela de aproximadamente 4mm2 y se extrae durante 15 a 30 minutos con reactivo de Cieland (Ditriotreitol -DTT 0.05M); los extractos son utilizados para humedecer hebras de algodón prelavado o bien se pueden sacar directamente hebras de las telas con las manchas y humedecerlas en DTT por un lapso de tiempo igual.

El análisis se realizó por medio de métodos electroforéticos convencionales en cámaras horizontales SERI E005 a 5°C (Enfriador RTE 110) con geles de agarosa y/o almidón y utilizando pequeñas cantidades del extracto (5).

La mayoría de las electroforesis en Ciencias Forenses son de zona e involucran el desplazamiento de las proteínas en forma de manchas o bandas zonales (6). Las corridas electroforéticas se realizaron en grupos isoenzimáticos que comparten los mismos requerimientos en cuanto a la diferencia de potencial aplicada al medio, la fuerza iónica y viscosidad del medio, la temperatura y la masa molecular de la proteína (5).
 

Grupo I:

EsD y Giol: Gel agarosa-almidón 2%, 400V por 2 horas 20 minutos.

PGMsub. Gel agarosa 1%, 450V por 4 horas.
 

Grupo lI:

EAP, ADA y AK. Gel de almidón (8-1 0%), 150V por 16 horas.
 

Grupo lII:

Gc y Tf: gel de agarosa 1%, 400V por 1-2 horas.
 

Grupo IV:

CA II y PepA: Agarosa 1%, 400V por 2 horas.

 
El número esperado de fenotipos para cada enzima fue calculado asumiendo el equilibrio de Hardy Weimberg (7) y el estudio estadístico de significancia se realizó mediante la prueba de Chi cuadrado, para ello se utilizó el programa ALFA del paquete GENIOC del Instituto Oswaldo Cruz de Río de Janeiro, Brasil. La capacidad de un marcador genético para distinguir entre individuos se relaciona con la frecuencia de sus fenotipos en una población dada. El valor médico legal o forense de un marcador genético se da por su capacidad de eliminar o discriminar entre individuos de una población y para ello se debe calcular el poder de discriminación (8).

Siendo Q la probabilidad de encontrar un pareo entre dos individuos seleccionados al azar usando un sistema genético dado, conociendo las frecuencias p de los k fenotipos de este sistema tenemos que (8):
 

 

Si tenemos m sistemas independientes con sus correspondientes valores de Q, la probabilidad de poder distinguir entre dos individuos o Poder de Discriminación (DP) utilizando estos m sistemas se da por(8):

 

 
 

Resultados

Los valores de las frecuencias alélicas de los 10 sistemas enzimáticos encontrados en la población costarricense, y los valores de bondad de ajuste a la prueba de Chi cuadrado se presentan en los cuadros 1 y 2.

Los resultados del cálculo de la probabilidad de discriminación para cada uno de los sistemas estudiados se presentan en cuadros 3 y 4.
 

Discusión

Las frecuencias fenotípicas encontradas están en equilibrio de Hardy Weimberg y los valores de Chi cuadrado no son significativos. Dado que la proporción de fenotipos heterocigotos encontrados guarda relación con los esperados se puede afirmar que no se encontró subestructura poblacional para estos marcadores en la muestra analizada. Los resultados obtenidos en la muestra de la población general de Costa Rica son similares a los reportados en estudios poblacionales que incluyen grupos hispano-norteamericanos y caucásicos. Se puede citar que en grupos poblacionales de caucásicos e hispanos norteamericanos, la Adenosindeaminasa (ADA) presenta frecuencias de ADA*1=0.9483 y 0.9765 respectivamente (8,9) y en la muestra analizada encontramos una frecuencia de ADA*1= 0.966. En Glioxilasa, las frecuencias génicas reportadas en la población caucásica europeos para Glo*1 y Glo*2 son iguales a las del presente estudio donde ambos genes se manifiestan en la población con frecuencias muy similares. Se muestra una franca diferencia de los valores reportados para Glo*1 en poblaciones japonesas, con frecuencias cercanas a 0.9 (11). Este fenómeno puede también observarse con la Anhidrasa carbónico donde la frecuencia en caucásicos es de Ca*1= 0.9946 y la encontrada en el presente estudio es de Ca*1= 0.9946, valores que dan muy poco margen a la frecuencia del gen Ca*2 con valores que oscilan entre 0.0054 a 0.0213, y en poblaciones negras norteamericanas se ve una mayor frecuencia del gen Ca*2= 0.0972 (9,10).

Los polimorfismos genéticos son características genéticas que se encuentran en todas las poblaciones pero cuya frecuencia varía entre ellas por lo cual han sido de gran utilidad en la caracterización de diferentes poblaciones y parece ser que la variación dentro de los grupos poblacionales existentes actualmente es mayor que la existente entre grupos (1) tal y como lo demuestra la comparación de los resultados obtenidos en el presente estudio con otros datos publicados.

La individualidad bioquímica es notable cuando se consideran muchos de los polimortismos presentes en la sangre y se llega a detectar la heterogeneidad genética existente entre los seres humanos. Es claro que cuanto más fenotipos tenga un sistema o más polimórfico sea y mejor distribuido esté en la población es mayor la posibilidad de que 2 personas escogidas al azar sean diferentes.

Los resultados del cuadro 3 claramente mostraron que para estudios de identificación humana, los sistemas más informativos son los que presentan una mayor variabilidad y por ende permiten una mejor individualización al tener un alto poder de discriminación como los encontrados en PGM subtipeo, EAP, Glo I, Gc y EsD.

Sistemas poco informativos resultaron ser lo que tienen poca variabilidad entre la población como AK, ADA, PepA, Hb, CA II y Tf (Cuadro 3), por lo cual, este estudio permitió evaluar cuáles marcadores genéticos isoenzimáticos eran los más informativos y así eliminar del análisis rutinario las isoenzimas cuyo poder de discriminación es bajo y su aporte resulta ser insignificante al valor combinado del poder de discriminación; de esta forma se mejora el tiempo de respuesta y se disminuyen costos.

Desde la perspectiva criminalística un valor combinado de exclusión forense alto como el encontrado (Cuadro 4) implica que es poco probable encontrar dos personas que por azar posean el mismo perfil genético.
 
 

CUADRO 1   DISTRIBUCIÓN FENOTIPICA Y FRECUENCIAS ALÉLICAS EN LA POBLACIÓN COSTARRICENSE PARA EsD, GLO, EAP, AK, PepA.  

Fenotipo	Observados	Esperados	Frecuencias Génicas
EsD 1-1	435	434.10	EsD*1     .88303
EsD 2-1	110	111.96	EsD*2     .11697
EsD 2-2	10	8.94
Total:	555		X2    0.162
Glo 1-1	58	68.14	Glo*1     .44728
Glo 2-1	180	159.81	Glo*2     .55272
Glo 2-2	93	103.41
Total:	331		X2    5.036
EAP AA	23	22.73	EAP*A     .25170
EAP BB	175	175.32	EAP*B     .71489
EAP BA	117	118.08	EAP*C     .03341
EAP CB	13	15.67
EAP CC	2	.63
EAP CA	6	5.52
Total:	336		X2    3.508
AK 1-1	190	190.0	AK*1     .9847
AK 2-1	6	6.0	AK*2     .0153
AK 2-2	0	0.0
Total:	196		X2    0.047
PepA 1-1	126	126.26	PepA*1     .9565
PepA 2-1	12	11.48	PepA*2     .0434
PepA 2-2	0	0.26
Total:	138		X2    0.285

  EsD: Esterasa D, Glo: Glioxilasa, EAP: Fosfatasa Acida Eritrocitaria. AK: Adelinato Quinasa, PepA: Peptidasa A. X² = Prueba de Chi Cuadrado
 
 
  CUADRO 2 DISTRIBUCIÓN FENOTÍPICA Y FRECUENCIAS ALÉLICAS EN LA POBLACIÓN COSTARRICENSE PARA Gc, PGMsub, ADA, CAII, Tf  

Fenotipo	Observados	Esperados	Frecuencias Génicas
Gc 1-1	280	275.03	Gc*1     .7682
Gc 2-1	156	165.94	Gc*2     .2318
Gc 2-2	30	25.03
Total:	466		X2     1.6720
PGM 1+1+	101	101.59	PGM*1+     .4725
PGM 1+1-	120	122.38	PGM*1-     .2846
PGM 1+2+	65	61.90	PGM*2+     .1439
PGM 1+2-	43	42.53	PGM*2-     9.8901
PGM 1-2-	39	36.86
PGM 1-2+	37	37.28
PGM 1-2-	24	25.61
PGM 2+2+	9	9.42
PGM 2+2-	11	12.96
PGM 2-2-	6	4.45
Total:	455		X2     1.2932
ADA 1-1	194	194.20	ADA*1     .9686
ADA 2-1	13	12.59	ADA*2     .0314
ADA 2-2	0	0.20
Total:	207		X2     0.218
CA 1-1	180	180.0	CA*1     .9787
CA 2-1	8	7.8	CA*2     .0212
CA 2-2	0	0
Total:	188		X2     0.89
Tf CC	179	179.25	Tf*C     .9637
Tf CB	5	4.81	Tf*B     .0129
Tf CD	9	8.67	Tf*D    .0233
Total:	193		X2     0.273

  Gc:Componente Grupo específico, PGM: fosfoglucomutasa, ADA: adenosindeaminasa, CA: Anhidrasa carbónica, Tf: Transferrina X² Prueba de Chi cuadrado
 
 
  CUADRO 3 PROBABILIDAD DE EXCLUSIÓN DE 10 SISTEMAS  ENZIMÁTICOS  

Locus	Q	DP por locus
EsD	.6530	.3470
PGM sub.	.1657	.8342
Glo I	.3264	.6736
EAP	.4048	.5951
Gc	.4770	.5220
AK	.9404	.0595
ADA	.8820	.1179
PepA	.8410	.1589
Ca II	.9184	.0815
Tf	.8628	.1371
DP Combinado	.9963

 
                                    DP: Poder de Discriminación
 
 
  CUADRO 4 PROBABILIDAD DE EXCLUSIÓN DE 5 SISTEMAS ENZIMÁTICOS  

Locus	Q	DP por locus
EsD	.6530	.3470
PGM sub.	.1657	.8342
Glo I	.3264	.6736
EAP	.4048	.5951
Gc	.4770	.5229
DP Combinado	.9932

 
                                    DP: Poder de Discriminación
 
 
 
 
Referencias

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5-Harris H, Hopkins DA. lntroduction. In: Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics. Oxford: North Holland Publishing Company, 1976:1-12.         [ Links ]

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7-Wallace. The Hardy Weimberg equilibrium. In: Basic population's genetics. New York: Columbia University Press; 1981.         [ Links ]

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9-Gaensslen RE, Bell SC, Lee HC. Distribution of genetics markers in United States populations: II Isoenzime system. J For Sci 1987;32:1348 -1381.         [ Links ]

10-Mortimer C, Berk C, Smith F, Hagins AM. Population frequency of esterase-D and carbonic anhydrase II isoenzymes. Paper delivered at 30th Annual Meeting, Amer. Acad. Forensic Sci. 1978, St. Louis, MO.         [ Links ]

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¹ Laboratorio de Bioquímica, Poder Judicial