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Revista Costarricense de Ciencias Médicas

Print version ISSN 0253-2948

Rev. costarric. cienc. méd vol.19 n.3-4 San José Dec. 1998

 

Leptospira interrogans: primeros aislamientos de humanos en Costa Rica
 
 
Ricardo García Jiménez *,  Warner Bustamante García,  Silvia Villalobos Bastos,
María Auxiliadora Marín Noguera
 
 

Resumen
 
La leptospirosis es una zoonosis que puede causar un amplio espectro de manifestaciones clínicas en humanos. Puede ser difícil orientar el diagnóstico, si no se toma en cuenta en el diagnóstico diferencial de los cuadros febriles agudos. Se requiere además, de técnicas especiales para obtener un diagnóstico microbiológico. (1-4).

Dado que en el Hospital de Ciudad Neily (HCN) son frecuentes los casos de pacientes con diagnóstico de cuadro febril agudo sin causa determinada y teniendo en cuenta el antecedente de una epidemia surgida en octubre de 1988 en Ciudad Cortés, donde el diagnóstico presuntivo de leptospirosis se estableció mediante datos clínicos y serológicos (5), nos propusimos aislar el agente etiológico para confirmar la existencia de infecciones por Leptospira interrogans en seres humanos, esclarecer el diagnóstico de algunas de estas fiebres agudas y obtener serovares autóctonos para futuras investigaciones.

En el período comprendido entre junio de 1995 y junio de 1996, se realizaron 228 hemocultivos por Leptospira sp en pacientes con cuadros febriles agudos, los cuales consultaron el Servicio de Emergencias Médicas del HCN; se obtuvieron 6 aislamientos (2,6%) identificados como Leptospira interrogans, tres de pacientes varones, dos de mujeres y uno que por error en la identificación del cultivo no se pudo conocer su procedencia. Todos los aislamientos se obtuvieron entre los meses de julio a setiembre de 1995, coincidiendo con la época de mayor precipitación pluvial en la Región del Pacífico Sur del país.

Se hace una breve descripción de los casos y finalmente se discute la importancia de obtener cepas autóctonas para la investigación y el desarrollo de métodos alternos de diagnóstico más oportunos, sensibles y específicos.
 
Palabras claves

Leptospira interrogans - leptospirosis - aislamiento en humanos.
 
Abstract

This summary reports the main findings of an attempt to isolate Leptospira interrogans in blood in febrile patients at the Hospital de Ciudad Neily in Costa Rica during 1995 and 1996. Leptospirosis is an spirochaetal zoonosis that may cause wide clinical variation in humans. Early detection can be delayed if the disease is not suspected in acute febrile episodes. Also, bacterial diagnosis requieres specialized diagnostic procedures (1-4).

Before this study, an epidemic of leptospirosis was observed in a neraby geographical area. During this epidemic period the diagnosis was established by clinical and serological methods (5). After that experience we decided to search and isolate the bacteria in human blood samples. To improve the posibilities we selected acute febrile patients with different conditions.

During a 12 month period (from July 1995 to June 1996) 228 hemocultures were done. Among these 228, six positive blood cultures were obtained and identified as Leptospira interrogans. The blood samples of these cases were obtained during the period from July to September of 1995. Three cases were males, two females. In one case the sex was not registered. The period of isolation corresponds to the period of heavy precipitation in this part of the country.

Two of the samples underwent further analysis at the Institute of Tropical Medicine in Holland. Both correspond to Sejroe group. The bacteriological methods are described in detail.

Key word

Leptospira interrogans. Leptospirosis. Culture isolation in humans.
 
Introducción

El género Leptospira comprende dos especies: L. interrogans y L. biflexa, cada una de las cuales incluye un gran número de tipos serológicos, denominados serovares. L interrogans de la que se conocen unos 200 serovares, es parásita de animales, incluyendo humanos, mientras que cepas de L. biflexa son saprófitas y se encuentran por lo común en el agua y el suelo (1- 3).

Las leptospiras son espiroquetas que presentan enrollamientos muy estrechos, tienen de 6 a 20 um de longitud y 0.1 um de diámetro. Se distinguen por su activa movilidad, consecuencia de la rotación del organismo, y se las identifica fácilmente, por sus característicos ganchos en uno o ambos extremos. Las leptospiras son aeróbios obligados que cuando se les cultiva en un medio adecuado a 30 °C, se reproducen en un lapso de 7 a 12 horas (1- 3).

La infección por leptospira se produce generalmente por contacto de la piel lesionada o de las mucosas con el agua, el suelo o alimentos contaminados con la orina infectante de una gran variedad de animales portadores, silvestres y domésticos. La enfermedad también se transmite en forma directa por contacto con la orina o tejidos de animales infectados. Las leptospiras patógenas que penetran al organismo, invaden inmediatamente la corriente sanguínea en la que se multiplican, dando origen a una fase leptospirémica, que dura de 7 a 10 días desde el inicio de la enfermedad, durante la cual es posible aislarlas de la sangre. Las leptospiras se establecen en los túbulos renales, a consecuencia de lo cual, se produce una leptospiruria de duración variable según la especie animal infectada, en el curso de la cual se puede aislar de la orina o del tejido renal de los animales que sobreviven (1- 4).

En el mes de octubre de 1988 se produjo en Ciudad Cortés, provincia de Puntarenas, un brote de 56 casos de leptospirosis anictérica, los cuales se dieron en el marco de las inundaciones provocadas por el huracán Juana. El diagnóstico se basó en datos clínicos y prueba serológica de aglutinación microscópica (MAT) (5).

Debido a la frecuente aparición de fiebres agudas sin causa determinada, y a que en Costa Rica hasta la fecha no se ha reportado el aislamiento en humanos de Leptospira interrogans, nos propusimos aislar este microorganismo de la sangre de pacientes con cuadros sintomáticos semejantes a leptospirosis. El objetivo principal fue demostrar la presencia de este patógeno, mediante aislamiento bacteriológico en pacientes de la zona sur del país, esclarecer la etiología de algunos cuadros febriles agudos, crear conciencia en el cuerpo médico sobre esta enfermedad, como parte del diagnóstico diferencial a establecer ante los casos de cuadros febriles agudos, establecer un procedimiento de diagnóstico bacteriológico, factible con los recursos de los laboratorios clínicos de la C.C.S.S. y obtener serovares autóctonos para futuras investigaciones en el campo del diagnóstico serológico.

  Materiales y métodos
 
El estudio se realizó en el Hospital de Ciudad Neily, en el período comprendido entre el 1 de junio de 1995 al 1 de junio de 1996.

Se cultivaron 228 muestras de sangre en el medio específico para el aislamiento de Leptospira sp según Ellinghausen-McCullough-Johnson-Hams (EMJH) de la casa comercial DIFCO. Todos los pacientes fueron remitidos por el Servicio de Emergencias Médicas y presentaban cuadro febril agudo. De ellos 135 (59.5%) eran hombres y 92 (40.5%) mujeres, para un total de 227 pacientes, a uno de ellos se le realizaron dos cultivos. No se agruparon por edad ya que no fue posible obtener este dato para todos los casos, sin embargo, la edad mínima fue de 7 meses y la máxima de 88 años.

Toma de la muestra: Se tomaron entre 3 y 5 ml de sangre por cada paciente, con jeringa plástica, desinfectando la zona de la punción con alcohol yodado estándar. Este procedimiento se practicó en momentos en que la temperatura fuera mayor de 38ºC.
 
Inóculo del medio de cultivo:

A) Procedimiento # 1: En un inicio se depositó 0,5 ml de sangre sin anticoagulante en dos tubos conteniendo 4,5 ml del medio de cultivo EMJH enriquecido. Lo anterior para obtener una relación 1:10 sangre/medio de cultivo, que es lo usual en hemocultivos rutinarios.

B) Procedimiento # 2: Posteriormente, los inóculos se realizaron en tres tubos a razón de 2 y 3 gotas de sangre en cada tubo con 4,5 ml del medio líquido y 3 gotas en un tubo con 4,5 ml de medio semi-sólido, el cual se obtiene agregando al preparado original de EMJH, agar en una concentración de 0,5% (2, 3).

Revisión de los cultivos: Cada tubo fue rotulado y colocado en una incubadora a una temperatura controlada de 30°C y en oscuridad. Los cultivos se revisaron semanalmente por microscopía de campo oscuro durante 2 meses(1, 2).

Prueba de tamizaje de macroaglutinación en lámina: A 175 pacientes se les realizó una prueba cualitativa de macroaglutinación en lámina (TR) para Leptospira de la casa comercial Sanofi Pasteur. El antígeno TR es una preparación de Leptospira biflexa el cual ha sido tratado por procedimientos físicos, de manera que ha desaparecido la especificidad de serotipo(6).

Para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas en la proporción de varones y mujeres con prueba TR positivas, se empleó la Prueba t de Studens para proporciones. Para descartar o no, la asociación entre el cultivo y el examen serológico TR, se empleó la prueba para pares correlacionados de MacNemar(7):

Determinación de anticuerpos IgM a virus del Dengue: Como diagnóstico diferencial, se remitió suero de todos los pacientes al INCIENSA, donde se les practicó determinación de IgM por Dengue, por método de ELISA de captura.

Descripción de los casos: Se realizó una breve revisión de la historia clínica de los pacientes a quienes se les aisló la bacteria, destacando los hallazgos clínicos y de laboratorio, en algunos casos se completaron aspectos epidemiológicos por medio de entrevista en el domicilio de estas personas.
 
Resultados

Cultivos: Se obtuvieron 6 aislamientos de Leptospira interrogans en las 228 muestras cultivadas, lo que corresponde al 2,6%. De los cultivos realizados mediante el procedimiento de inoculación # 1 se aisló 3 cepas y con el procedimento # 2 se aislaron otras 3 cepas; con ambos procedimientos el porcentaje de contaminación fue del 6%. En promedio, la positividad se detectó a los 31 días después de inoculada la muestra. El cultivo que se detectó más tempranamente fue a los 5 días de la inoculación y el más tardío se detectó luego de 50 días de inoculado el medio.

La edad promedio de los pacientes con aislamiento positivo fue de 37,6 años, de ellos, 3 eran varones con edades comprendidas entre los 16 a los 41 años y dos eran mujeres con edades entre los 50 a los 53 años. Del otro caso, lamentablemente se desconoce todo dato clínico y demográfico, debido a que el cultivo no se identificó adecuadamente.

Los dos primeros aislamientos se analizaron por MAT en el Instituto de Medicina Tropical de Holanda (KIT), contra un panel de antisueros de conejo y sólo reaccionaron con el antisuero Hardjoprajitno (serovariedad hardjo) del grupo Sejroe. El análisis con antisueros monoclonales del grupo Serjoe, para determinar la serovariedad quedó pendiente.

Estas 6 personas se dedicaban permanente o temporalmente a labores agropecuarias. La enfermedad se manifestó en los meses de julio a setiembre de 1995, coincidiendo con la época de mayor precipitación pluvial en la región del estudio.

Todos los pacientes tuvieron una presentación clínica anictérica benigna, que se caracteriza por fiebre repentina, dolor de cabeza de leve a severo, mialgias, escalofríos, dolores articulares, y postración. En nuestra casuística, fue importante la presencia de inyección conjuntival (50%).

Hematológicamente tenían en común un recuento total de leucocitos dentro de límites normales y neutrofilia relativa de entre el 80% al 90%.

Prueba serológica de macroaglutinación en lámina TR: Esta prueba de tamizaje se practicó en 175 personas de la muestra estudiada, con resultados positivos en el 28,6% de los casos. Dentro del grupo de los hombres, la positividad (50 casos) fue del 32.7%, y dentro del grupo de las mujeres, la positividad (15 casos) fue del 22% (cuadros # 1 y # 2). No se encontró diferencia estadística entre el grupo de hombres y el de mujeres (p > 0.05).

Anticuerpos IgM contra virus del Dengue: Solamente en un suero (0.4%) de la muestra estudiada, se detectaron anticuerpos IgM contra los virus del Dengue (cuadro #2).

 

CUADRO 1
MUESTRA POR TIPO DE ANALISIS Y SEXO
LABORATORIO CLINICO H.C.N.
(junio de 1995 a junio de 1996)
 
 
Tipo análisis
Hombres (%)
Mujeres (%)
Totales
Cultivo (EMJH)
136 (59,6%)
92 (40,4%)
228
 
Serología dengue
136 (59,6%)
92 (40,4%)
228
 
TR
107 (61%)
68 (39%)
175
 
 

 

CUADRO 2
PORCENTAJE DE POSITIVIDAD SEGÚN MÉTODO:
CULTIVO, TÉCNICA DE MACROAGLUTINACIÓN (TR) E IgM (ELISA) DENGUE
 

LABORATORIO CLINICO H.C.N.

 
Laboratorio Clínico H.C.N.
Método
No. de positivos %)
Total de muestras
Cultivo 1*
3 (3,7)
81
Cultivo 2**
3 (2)
147
Macroaglutinación (TR)
50 (28,6)
175
IgM Dengue
1 (0,4)
227
 
          Cultivo 1, son cultivos realizados según el procedimiento de inoculación # 1.
          Cultivo # 2, son cultivos realizados según el procedimiento de inoculación # 2.
          * 5 cultivos contaminados (6,2%)
         * * 9 cultivos contaminados (6,1%)
        Fuente: Laboratorio Clínico Hospital de Ciudad Neily. INCIENSA.
 
 
Descripción de los casos
 
Paciente # 1: Femenina, 53 años, ama de casa, dedicada a la recolección de coyoles. Ingresa por cefalea intensa, fiebre, mialgias e inyección conjuntival. Tres meses después del egreso hospitalario aun presentaba fuertes dolores de cabeza.

Laboratorio: El hemograma presentó leucocitosis con neutrofilia. No se le efectuaron pruebas de función hepática ni renal.

El cultivo resultó positivo a los 5 días. Por ser el primer caso aislado, se mandó repique del cultivo y muestra de suero al Instituto de Medicina Tropical en Holanda (KIT), de donde informan que la cepa aislada reaccionó solamente con el antisuero Hardjoprajitno (serovariedad Hardjo) del serogrupo Serjoe.

Por MAT, el suero de la paciente dio un título de 1:2560 contra cepas de la serovariedad Hardjoprajitmo y M 84 ambas del serogrupo Sejroe. El ELISA por Ig M dio un título de 1:1280.

Recibió tratamiento antibiótico con cefalexina.

Paciente # 2: Se desconoce todo dato clínico y demográfico, debido a extravío de la documentación que identificaba a la muestra.

Paciente # 3: Masculino de 16 años y estudiante, ocasionalmente trabaja en arrozales. Ingresa al hospital por fiebre de más de tres días, mialgias severas, cefalea, sin signos meníngeos.

Laboratorio: Los análisis hematológicos presentan un conteo total de leucocitos normal con neutrofilia. La serología (TR) fue negativa y el cultivo por Leptospira interrogans resultó positivo a los 37 días. No se le realizaron pruebas de función hepática o renal.

Al ser entrevistado manifestó que el único tratamiento recibido fue acetaminofén. No recibió terapia antibiótica.

Paciente # 4: Masculino, 41 años, porcicultor; ingresa al hospital con cefalea intensa, conjuntivas enrojecidas, nauseas, vómitos incontrolables, dolor de huesos, escalofríos, sudoración, fiebre de tres días de evolución (41°C). No presentó signos meníngeos, ni foco infeccioso evidente.

Laboratorio: Se le realizó hemograma encontrándose un conteo total de leucocitos normal con neutrofilia y presencia de bandas. Pruebas febriles y gota gruesa negativas, la serología por dengue, y el hemocultivo de rutina fueron negativas. El sedimento urinario presentó 20 leucocitos e incontables eritrocitos por campo de 450 X. No se efectuaron pruebas bioquímicas para evaluar función hepática ni renal. La macroaglutinación por Leptospira fue negativa.

El cultivo por Leptospira interrogans resultó positivo luego de 50 días de incubación.

Tratamiento: voltarén y penicilina procaínica.

Paciente # 5: Masculino, 28 años, agricultor. Ingresa por un cuadro febril de 5 días de evolución, presentando mialgias, dolor de ojos, cefalea, náuseas, dolor de cuerpo, ictericia y conjuntivas enrojecidas.

Laboratorio: Se le realizaron exámenes hematológicos, presentando un conteo total de leucocitos normal con presencia de neutrofilia y bandas. Presentaba la alanino amino transferasa (ALT) ligeramente aumentada (60 UI/l, valor de referencia hasta 37 UI/L), gamma glutamil transferasa ( -GT) moderadamente elevada (86 UI/l, valor de referencia hasta 57 UI/L) y bilirrubinas totales ligeramente aumentadas (1,2 mg/dl, valor de referencia hasta 1,1 mg/dl). La gota gruesa, pruebas febriles, y serología por dengue resultaron negativas.

La macroaglutinación por Leptospira fue positiva y el cultivo resultó positivo a los 33 días de inoculado.

Paciente # 6: Paciente femenina de 50 años de edad. No se pudo localizar el expediente clínico. Solo se aportan los siguientes datos de Laboratorio: conteo de leucocitos normal con neutrofilia, la serología por macroaglutinación resultó positiva. El cultivo fue positivo a los 32 días.

 Discusión

El resultado de este estudio, pone en evidencia la magnitud de la leptospirosis en la muestra estudiada. El 2.6% de aislamientos obtenidos de las muestras sanguíneas, nos hace sospechar que la verdadera proporción de la enfermedad posiblemente era mayor, ya que debemos tomar en cuenta que Leptospira interrogans es una bacteria fastidiosa, que con frecuencia no crece en medios de cultivo (1- 3). Además, la leptospiremia suele ser muy baja. La experiencia de los investigadores del KIT, en la detección de Leptospira sp mediante la técnica de PCR, cuyo umbral de detección es de 1 leptospira por mililitro, es que en el caso de muestras sanguíneas ocurren fallas de hasta un 50%, sugiriendo que esto puede ser debido a la baja cantidad de leptospiras en la etapa leptospirémica. Utilizando orina fresca como muestra, fueron capaces de detectar las leptospiras en el 90% de las muestras. Al estudiar orina y suero de siete pacientes en los primeros 8 días de la enfermedad, detectaron leptospiras en todas las muestras de orina y solamente 2 de los 7 sueros correspondientes dieron resultado positivo(8). Por lo anterior, recomendamos en caso de ser posible, realizar además del cultivo de sangre, un cultivo de orina fresca posterior a la primera semana de la enfermedad. Puesto que las leptospiras son excretadas en la orina en forma intermitente, es necesario examinar al menos dos muestras. Como en la práctica es muy difícil obtener muestras de orina totalmente libres de gérmenes, es conveniente preparar una serie de diluciones en razón de 10 de la muestra, en solución salina estéril amortiguada con fosfatos (SAF), hasta obtener cinco diluciones. Luego se inoculan dos series de tubos con medio líquido o semisólido, una serie sin aditivos y a la otra, debe adicionársele un descontaminante tal como, 5-fluororacilo, neomicina, furazolidina o rifampicina, en las proporciones adecuadas(1-3, 8).

La Macroaglutinación en Lámina (TR), es una técnica de tamizaje que se debe practicar en los primeros días de la enfermedad ya que detecta anticuerpos IgM principalmente. La alta proporción de sueros positivos (28.6%), obtenida mediante esta técnica, pudo deberse a dos aspectos principales:

a) La falta de experiencia del personal del laboratorio para interpretar esta prueba, la cual presenta el inconveniente de que la aglutinación que produce el control positivo aportado con los juegos de reactivo es poco evidente.

b) El preparado de antígeno TR, es realizado a partir de una cepa de Leptospira biflexa, el cual se obtiene por medio de procedimientos físicos que eliminan la seroespecificidad (6). En nuestro caso, tuvimos la oportunidad de realizar esta prueba contra el suero de un paciente VDRL positivo 1/64 diluciones, dando evidentemente positiva la macroaglutinación. Por lo tanto sugerimos, que esta prueba puede dar falsos resultados positivos en caso de realizarse con sueros de personas que padecen de otra enfermedad espiroquetal. En un estudio realizado en Tailandia informan, que 6 de 12 sueros de pacientes con sífilis, fueron reactivos utilizando técnica de anticuerpos inmunofluorescentes. En este caso, el antígeno utilizado fue obtenido de un cultivo de Leptospira interrogans serovariedad bataviae sin tratamiento previo para eliminar seroespecificidad (9).

A pesar de la aparente incongruencia en los resultados obtenidos, mediante el tamizaje por macroaglutinación respecto a los cultivos, no se pudo establecer independencia estadística, mediante la Prueba 2 para pares correlacionados de Mac Nemar (Cuadro # 3)

El diagnóstico y la sospecha clínica de esta enfermedad, pasa frecuentemente desapercibida, así en un estudio de vigilancia realizado en Hawai, los médicos sospecharon leptospirosis al inicio del cuadro clínico y solamente en el 30% de los pacientes en los cuales el diagnóstico de leptospirosis fue confirmado (4).
 

CUADRO  3

RESULTADO DE CULTIVOS VERSUS SEROLOGÍA
POR MACROAGLUTINACIÓN

Cultivo
                          Serología por macroaglutinación
Positiva
Negativa
Total
 
Positiva
2
3
5
Negativa
19
86
105
Total
21
89
110
 
           X2 tabular para niveles de significancia de un 5% y 1%, con 1 grado de libertad, son 3,841 y 6,635 respectivamente.
           X2 calculada = 9,33.  P < 0,01.
 

La presente experiencia nos sugiere que la prevalencia de esta patología debe ser importante en el ámbito nacional, y ha estado oculta debido a la poca experiencia en las técnicas diagnósticas de tipo bacteriológico y serológico, y a la falta de sospecha del clínico por este tipo de patología.

La obtención de estas 6 cepas reviste una gran importancia ya que se demuestra que es factible su aislamiento en laboratorios clínicos de mediana complejidad, de manera que abre la posibilidad de realizar un estudio en el ámbito nacional que permita identificar las zonas en donde este agente es endémico, las serovariedades representativas del país y obtener un banco de serovares que permitiría la investigación y el desarrollo de técnicas serológicas o de tipo genético que permitan realizar un diagnóstico y una vigilancia epidemiológica oportuna y efectiva ante casos aislados o brotes epidémicos de esta enfermedad. Varios autores recalcan la importancia de utilizar cepas regionales en el diagnóstico serológico, ya que esto aumenta la sensibilidad de estos métodos (9, 10).
 
Agradecimientos

A la Msc María Antonieta López Antillón de la Dirección Técnica de Servicios de Salud, por sus valiosas sugerencias. A los Doctores Carlos Zamora Z. y Manuel Rojas Montero por la revisión técnica y crítica del mismo.
 
Referencias
 
1. Myer D M. Leptospirosis. Manual de métodos para el diagnóstico de laboratorio. Centro panamericano de zoonosis. Nota técnica # 30, OPS/OMS, 1985: 1-46.         [ Links ]

2. Faine S. Leptospira and leptospirosis. CRC Press, Inc: USA, 1994: 1-354         [ Links ]

3. Lennette E., Spaulding E., Truant J. Manual of Clinical Microbiology. Editorial Board, 2° ed, 1974: 347-354.         [ Links ]

4. Wesley R. Leptospirosis. Clin Infect Dis 1995; 21: 1-8.         [ Links ]

5. Boza R. Leptospirosis anictérica: análisis de una epidemia en Costa Rica. Acta Méd Cost 1990; 33 (2): 74-80.         [ Links ]

6. Mazonelli J., Dorta G., Mailloux M. Recherche sur les antigenes des Leptospires. Tropenmed Parasit 1975; 26: 35-42.         [ Links ]

7. Cura E., Wendel S. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serología de los bancos de sangre. OPS; 1994: 22.         [ Links ]

8. Bal E., Gravekamp C., Hartskeerl R., De Meza-Brewster J., Korver H., Terpstra W. Detection of Leptospires in Urine by PCR for Early Diagnosis of Leptospiros. J Clin Microb 1994; 32: 1894-8.         [ Links ]

9. H. Appassakij, Silpapojakul K., Wansit R., Woodtayakorn J. Evaluation of the Inmunofluorescent Antibody Test for the Diagnosis of Human Leptospirosis. Am J Trop Med Hyg 1995; 52: 340-343.         [ Links ]

10. Aritsu Y., Kmety E., et al. Evaluation of the one-point microcapsule aglutination test for diagnosis of leptospirosis. Bul WHO 1994; 72: 395-399.         [ Links ]
 

* Correspondencia: Ricardo García Jiménez. D.T.S.S.S. -C.C.S.S-Laboratorio Clínico, Hospital de Ciudad Neily C.C.S.S.. Costa Rica.