Introducción

El exceso de gases liberados a la atmósfera genera un progresivo aumento de la temperatura y de dióxido de carbono (CO₂), produciendo procesos globales de cambio climático. Estos procesos afectan a los sistemas naturales y humanos en todos los continentes y en los océanos (^{IPCC, 2014}). Debido a que el calentamiento de los océanos genera cambios en la circulación oceánica, en los patrones climáticos regionales y en la distribución de las precipitaciones; ocurren cambios físicos en el ambiente y esto produce estrés en los ecosistemas (^{Przeslawski, Ahyong, Byrne, Woerheide & Hutchings, 2008}; ^{Brierley & Kingsford, 2009}). El océano ha absorbido más de un 80 % del calor incorporado al sistema climático y, en consecuencia, la temperatura media del mar ha aumentado alrededor de 0.6 °C en los últimos 100 años (^{IPCC, 2013}). Las predicciones plantean que para el año 2100 la temperatura superficial del mar se incremente de 0.3 a 4.8 °C (^{IPCC, 2013}). Dado que las zonas costeras son muy vulnerables y que sus ecosistemas son especialmente sensibles a las presiones ambientales como los cambios en la temperatura (^{IPCC, 2014}), es esperable que los invertebrados y sus ecosistemas se vean afectados de forma aguda como también crónica, con efectos que van desde subletales a letales y variando durante su ciclo de vida (^{Przeslawski et al., 2008}).

La temperatura del agua es el principal factor que determina el óptimo funcionamiento del metabolismo de los invertebrados marinos (^{Hochachka & Somero, 2002}). En general, un aumento de temperatura afecta la asimilación de alimentos, el crecimiento (^{Kemp & Britz, 2008}; ^{Gooding, Harley & Tang, 2009}), la respiración (^{McElroy, Nguyen & Byrne, 2012}), el desarrollo de las gónadas, reproducción (^{Olive, 1995}; ^{Bates, 2005}) y la supervivencia en los invertebrados marinos (^{Sanford, 2002}; ^{Gooding et al., 2009}; ^{González et al., 2010}; ^{McElroy et al., 2012}). A su vez, el aumento de las temperaturas del mar se ha relacionado con cambios en patrones temporales de desove en regiones templadas (^{Edwards & Richardson, 2004}; ^{Lawrence & Soame, 2004}).

El estado fisiológico es el principal determinante de la tolerancia de una especie a la variabilidad y cambio ambiental. Durante las últimas décadas hubo un renovado interés en la fisiología de los equinodermos, principalmente en la adaptabilidad de algunas especies frente a los cambios previstos de diferentes parámetros ambientales marinos (^{McGaw, Clifford & Goss, 2015}). En el caso particular de estudios sobre el posible efecto del cambio climático sobre los equinoideos, se los ha utilizado para estudiar los efectos sobre procesos fisiológicos tales como la respiración, la alimentación, reproducción, fertilización y, principalmente, el desarrollo larvario (^{Byrne, Andrew, Worthington & Brett, 1998}; ^{Kurihara & Shirayama, 2004}; ^{Byrne et al., 2009}; ^{Dupont & Thorndyke, 2009}; ^{Byrne, 2010}; ^{Cohen-Rengifo, García, Hernández, Hernández & Clemente, 2013}; ^{Wangensteen, Turon, Casso & Palacín, 2013}; ^{Delorme & Sewell, 2016}). Los equinoideos suelen tener un rango óptimo de temperatura en el cual se desenvuelven apropiadamente en cuanto a los procesos fisiológicos (^{Hochachka & Somero, 2002}; ^{Siikavuopio, Mortensen & Christiansen, 2008}; ^{Gooding et al., 2009}; ^{Azad, Pearce & McKinley, 2011}; ^{Watts, Hofer, Desmond, Lawrence & Lawrence, 2011}; ^{Siikavuopio et al., 2012}). Sin embargo, cuando los animales están expuestos a temperaturas fuera de ese rango, procesos fisiológicos como la alimentación, el crecimiento, el desarrollo de las gónadas y/o la supervivencia pueden verse comprometidos negativamente (^{Siikavuopio et al., 2008}; ^{Lawrence et al., 2009}; ^{Zamora & Jeffs, 2012}; ^{Uthicke, Liddy, Nguyen & Byrne, 2014}). Los cambios en el metabolismo pueden afectar de forma diferente las distintas funciones fisiológicas, así, en erizos de mar, tanto la linterna de Aristóteles (órgano masticador) como el caparazón (endoesqueleto) suelen mostrar respuestas a cambios ambientales de forma gradual (^{Lawrence & Ellwood, 1991}), mientras que los órganos internos, de metabolismo rápido, como las gónadas y el tracto digestivo, lo hacen a escalas de tiempo cortas (días a semanas) (^{Russell, 1998}).

La gran mayoría de las especies de equinoideos son herbívoros y cumplen funciones claves en los ecosistemas costeros que habitan, siendo capaces de alterar la abundancia, distribución y composición de las asociaciones de algas e invertebrados (^{Pérez, Gil & Rubilar, 2014}). Por lo tanto, cambios a nivel fisiológico individual con implicancias en la supervivencia y la reproducción de la población (^{Delorme & Sewell, 2016}) pueden tener consecuencia también a nivel de ecosistema (^{Paine, 1966}; ^{Harrold & Pearse, 1987}; ^{Hernández, Bückle, Guisado, Barón & Estavillo, 2004}). El erizo de mar Arbacia dufresnii presenta una amplia distribución a lo largo de la costa Argentina, siendo una de las especies dominantes en las comunidades bentónicas de los golfos norpatagónicos (^{Bernasconi, 1953}; ^{Brogger et al., 2013}; ^{Epherra, 2016}). Estudios en la población de A. dufresnii de Golfo Nuevo (Patagonia, Argentina) han mostrado que en años más cálidos se observa una mayor producción gonadal y un periodo de desove más prolongado (^{Epherra et al., 2015}). Por otro lado, estudios en laboratorio mostraron que el desarrollo embrionario y larval se ven afectados significativamente por un aumento de la temperatura (^{Fernández, Chaar, Epherra, González-Aravena & Rubilar, 2021}). Estos antecedentes fueron claves para plantear el estudio en condiciones controladas del efecto del aumento de la temperatura del agua de mar sobre parámetros morfológicos y reproductivos del erizo de mar Arbacia dufresnii (Echinodermata: Echinoidea).

Materiales y métodos

Muestreo: Se recolectaron 87 individuos adultos de Arbacia dufresnii (abril de 2016) mediante buceo autónomo en Punta Cuevas (Golfo Nuevo, 42°46’3’’ S & 64°54’51’’ W); los organismos fueron transportados al Servicio de Acuario Experimental del CCT CENPAT donde fueron aclimatados durante una semana en un acuario de 30 l a 14 °C (± 1), salinidad 33-34 ppm y un fotoperiodo de 12:12. Durante este tiempo, los erizos de mar no fueron alimentados con el objetivo de comenzar el experimento con todos los organismos en la misma condición.

Diseño experimental: Previo al comienzo del experimento, se individualizaron los organismos, se determinó el peso sumergido utilizando una balanza gravimétrica (0.01 g) y el diámetro máximo del caparazón mediante un calibre digital (0.01 mm) para cada uno. Se seleccionaron 15 individuos (ocho hembras y siete machos) al azar para establecer los parámetros a estudiar de la población natural (de ahora en más llamado “INICIO”) antes de comenzar el experimento. Éstos fueron anestesiados con Cl₂Mg 5 % previamente a ser diseccionados siguiendo recomendaciones de ^{Rubilar y Crespi-Abril (2017}) para determinar el peso de los órganos: gónadas, intestino (conjunto de esófago, intestino y ano), caparazón y linterna de Aristóteles. Los pesos secos (balanza gravimétrica, 0.001 g) se obtuvieron llevando los órganos hasta peso constante en estufa a 60 °C.

Los 72 individuos restantes fueron utilizados para llevar a cabo el experimento que tuvo una duración de ocho semanas (65 días), abarcando parte del periodo de gametogénesis de A. dufresnii, que transcurre principalmente en otoño e invierno (^{Brogger et al., 2010}; ^{Epherra et al., 2015}; ^{Rubilar et al., 2016}).

Se realizaron tres tratamientos utilizando como factor la temperatura del agua de mar: 13 °C (± 0.7), 15 °C (± 1.0) y 17 °C (± 0.7). De acuerdo con (^{Pisoni, Dellatorre & Rivas, 2017}), los valores promedio son 15.6 °C en abril, 13.9 °C en mayo y 12.4 °C en junio, por lo que el tratamiento a 13 °C es posible considerarlo como control, puesto que oscila entre los valores naturales para la época de estudio, mientras los otros dos tratamientos a 15 °C y 17 °C representan valores elevados para la época del año (^{Dellatorre, Pisoni, Barón & Rivas, 2012}; ^{Pisoni et al., 2017}). La segunda (15 °C) representa un incremento de dos unidades por encima del control, el aumento intermedio esperado para fines del siglo XXI y la última (17 °C) representa una temperatura extrema que podría llegar a darse de acuerdo con los modelos máximos calculados en zonas costeras para finales del siglo XXI (+4 °C), de no mediar la disminución de emisiones de dióxido de carbono (CO₂) a la atmósfera (^{IPCC, 2014}).

En cada tratamiento se utilizaron 24 individuos, separados individualmente para evitar la competencia por espacio y alimento. Cada acuario contenía 3 l de agua de mar filtrada (300 micras y filtro UV), un aireador y un filtro de canasta (biológico y mecánico) que permite asegurar la oxigenación y la calidad del agua. Se colocaron de a seis acuarios individuales dentro de un recipiente de plástico de mayor tamaño, con agua de mar y un calentador (Atman) asociado a un sensor de temperatura programado a la temperatura deseada. La salinidad del agua se mantuvo entre 33-34 ppm con un fotoperiodo de 12:12. Tanto la temperatura como la salinidad fueron monitoreadas y registradas diariamente. Previo al comienzo del experimento, se corroboró que no exista diferencia en el diámetro y peso sumergido (ANOVA, P = 0.96 y P = 0.46, respectivamente) entre tratamientos.

Durante el experimento, los ejemplares fueron alimentados ad libitum dos veces por semana con similar cantidad de alimento artificial (aprox. 400 mg, Texas A&M AgriLife Research) de acuerdo a ^{Rubilar et al. (2016}). Previamente a ser alimentados, se retiraron los restos de alimento no consumidos y las heces producidas y, a su vez, se realizaba un recambio de dos tercios del agua de mar filtrada en cada acuario, mediante succión del fondo con una manguera, para evitar acumulación de compuestos nitrogenados. Se monitoreó el estado de los individuos mediante la observación de pérdida de espinas (presencia de espinas en el fondo), desoves (color del agua), posición y movilidad de los individuos y mortalidad. Si un individuo moría durante el experimento se extraía inmediatamente.

Procesamiento de las muestras: Al finalizar el experimento, se determinó el peso sumergido utilizando una balanza gravimétrica (0.01 g), y el diámetro máximo del caparazón mediante un calibre digital (0.01 mm). Luego, los individuos fueron anestesiados con Cl₂Mg 5 % para ser diseccionados y así determinar el peso seco de los órganos (gónadas, intestino, caparazón y linterna de Aristóteles) de la misma forma que los individuos al inicio del experimento (INICIO). El sexo fue establecido por la coloración gonadal y análisis histológicos. Una porción de las gónadas fue fijada en Davidson por 24 h y conservada en etanol 70 %. El peso húmedo de esta porción fue registrado para luego corroborar el peso seco real de las gónadas de cada individuo. Para determinar los estadios gonadales se realizaron análisis histológicos de los tejidos de la gónada que se deshidrataron en una serie de alcoholes (70 %, 96 %, 100 %), luego se transparentaron los tejidos en xileno y, finalmente, fueron embebidos e incluidos en parafina. Los tejidos embebidos en parafina fueron seccionados cada 7 μm con micrótomo rotacional Leica RM2255 y se tiñeron siguiendo la técnica de tinción con hematoxilina y eosina (^{Wilson & Gamble, 2002}). Los preparados se observaron en un microscopio óptico Carl Zeiss DM2500 y las fotografías se obtuvieron utilizando una cámara Leica DFC 280. Los estadios gonadales se clasificaron considerando las células germinales y los fagocitos nutritivos de acuerdo con ^{Epherra et al. (2015}).

Al igual que al comienzo del experimento, 15 individuos adultos del erizo de mar A. dufresnii fueron recolectados de la población natural y procesados de la manera mencionada anteriormente, de ahora en más llamado FINAL. En este caso se hallaron siete hembras y ocho machos.

Para analizar el efecto de la temperatura y el sexo sobre los parámetros medidos (peso total sumergido, diámetro total del cuerpo, peso seco de las gónadas, intestino, linterna de Aristóteles y caparazón) se utilizaron Modelos Lineales Generalizados (GLM) (^{McCullagh, 1984}). En primera instancia, se realizó una exploración de datos gráfica para comprender la relación entre la variable respuesta y cada una de las variables explicatorias. Los gráficos de caja (Box-plot) se utilizaron para variables discretas y permitieron eliminar variables explicatorias que estén altamente correlacionadas. Para comprobar el ajuste a los datos, se observó la cantidad de varianza explicada por el modelo, la devianza (D²), la cual nos da una idea de la variabilidad de los datos. Los modelos fueron construidos del más simple (sin ningún factor) hasta el más complejo que incluye la interacción entre los factores (lo cual nos indica la dependencia de los factores), se analizaron y se seleccionó el mejor modelo con base en tres criterios: i) Criterio de información de Akaike (AIC del inglés Akaike Information Criterion, índice que evalúa tanto el ajuste del modelo a los datos como la complejidad del mismo); ii) Análisis de los residuos (análisis de los gráficos de residuos observados frente a estimados), y iii) Principio de parsimonia (el modelo debe ser tan simple como sea posible). En los resultados se muestran los valores AIC. Todos estos análisis fueron realizados con el software libre R (^{R Core Team, 2014}).

Para analizar el efecto de la temperatura del agua de mar sobre las variables peso total y diámetro del cuerpo, así como el peso seco del caparazón de los erizos se utilizaron como variables respuestas la variación del diámetro del cuerpo (diámetro final-diámetro inicial), la variación del peso total del cuerpo (peso final-peso inicial) y peso seco del caparazón al final del experimento; y como variables explicatorias, temperatura (niveles: 13 °C, 15 °C y 17 °C) y sexo (niveles: machos y hembras). Para estudiar el efecto de la temperatura del agua de mar sobre las variables peso seco de gónada, de intestino, de la linterna de Aristóteles se seleccionaron como variables explicatorias, la temperatura (niveles: 13 °C, 15 °C y 17 °C), sexo (niveles: macho y hembra); y a su vez se utilizó el diámetro final del cuerpo (DF) como covariable (variable explicatoria continua), ya que existe una relación alométrica entre el diámetro del caparazón y los órganos de los individuos (^{Ebert, Hernández & Russell, 2011}).

Para evaluar el efecto de la temperatura del agua de mar sobre la gametogénesis de los erizos, se realizó una descripción de los estadios gonadales. Mediante el análisis de la proporción en los cuales se encontraron en los distintos tratamientos de temperatura y en la población natural al inicio (INICIO) y final del experimento (FINAL). A diferencia de los objetivos anteriores en este se incorporan datos de la población natural.

Resultados

La supervivencia en cada tratamiento se muestra en la Tabla 1. Cabe destacar que en el tratamiento de 17°C, en un mismo día ocurrió la mortalidad de seis individuos (un cajón), los cuales mostraban signos de enfermedad ya que el agua presentaba turbidez y los organismos habían perdido espinas y se observaban signos de descomposición.

El modelo que presentó el mejor ajuste a los datos para variación del diámetro fue el que incluía el factor temperatura (Tabla 2), donde el tratamiento Temperatura = 15 °C presenta valores significativamente mayores respecto a las otras temperaturas (Fig. 1A, Tabla 3).

Fig. 1 Fig. 1 Media, error estándar y rango de la variación del diámetro (a) y del peso del cuerpo (b); y el peso seco del caparazón (c) de Arbacia dufresnii para cada temperatura separados por sexo, los asteriscos (*) indican la diferencia significativa. Mean, standard error and range of variation in diameter (a) and body weight (b); and the dry weight of the shell (c) of Arbacia dufresnii for each temperature separated by sex, the asterisks (*) indicate the significant difference. 

El mejor ajuste a los datos para variación del peso individual fue el modelo que incluía únicamente el factor sexo (Figura 1B, Tabla 2, Tabla 3). No se seleccionó el modelo nulo aunque la diferencia según el criterio de información de Akaike es muy baja, ya que al realizarle los estudios de los residuales el modelo seleccionado (Sexo) mostró mejor ajuste a los datos.

Los resultados de los tratamientos térmicos muestran que la temperatura y el sexo no son factores que expliquen la variación del peso seco del caparazón, puesto que el modelo seleccionado es el nulo (Figura 1C, Tabla 2, Tabla 3).

Respecto al análisis del peso seco de los órganos en los diferentes tratamientos térmicos, los modelos que mejor ajustan fueron diferentes según la variable analizada. En el peso seco de gónadas, tanto la temperatura como el sexo son los factores que mejor explican su variación entre tratamientos, el modelo seleccionado es el que presenta interacción entre los factores (Tabla 4). Los machos del tratamiento a 15 °C presentaron valores significativamente mayores (P < 0.05) respecto a hembras y a las otras temperaturas (Figura 2A, Tabla 5). El modelo nulo presentó el mejor ajuste a los datos según el criterio de información de Akaike, pero en los estudios de los residuales, el modelo seleccionado (Sexo) mostró mejor ajuste a los datos.

Fig. 2 Fig. 2 Media, error estándar y rango del peso seco de gónadas (a.), peso seco de intestino (b.), y peso seco de linterna (c.) de Arbacia dufresnii para cada temperatura separados por sexo, los asteriscos (*) indican la diferencias significativas. Mean, standard error and range of the dry weight of gonads (a.), Dry weight of intestine (b.), And dry weight of lantern (c.) of Arbacia dufresnii for each temperature separated by sex, the asterisks (*) indicate significant differences. 

Los resultados en peso seco de intestino muestran que la temperatura junto con la covariable DF son los factores que explican la diferencia, el modelo seleccionado es el que presenta aditividad entre éstos (Tabla 4). En detalle, el modelo seleccionado mostró que la temperatura 15 °C resulta significativamente mayor respecto a los demás niveles (Figura 2B, Tabla 5).

Los resultados en peso seco de la linterna de Aristóteles muestran que, al igual que en los individuos de campo, el sexo es un factor importante puesto que el modelo seleccionado es el que presenta aditividad entre los factores sexo y diámetro final (Figura 2C, Tabla 4, Tabla 5).

Estadios gonadales del erizo de mar Arbacia dufresnii: Previo al comienzo del experimento, en ambos sexos los estadios gonadales de los erizos de mar provenientes de la población natural predominantes fueron pregamético e intergamético. Al final del experimento, en ambos sexos predominaron los estadios de crecimiento y premadurez. Los diferentes tratamientos térmicos presentaron mayor diversidad de estadios gonadales respecto a la población natural (Figura 3A, Figura 3B).

En hembras, en el tratamiento de menor temperatura (13 °C) ningún estadio predominó sobre el otro, encontrándose individuos en estadio de crecimiento, premadurez, madurez e inclusive varios se encontraron desovados. Sin embargo, otros minoritarios no desarrollaron sus gónadas, pudiéndose observar un crecimiento nulo de las mismas. En el tratamiento de temperatura intermedia (15 °C), las hembras fueron más homogéneas, el mayor porcentaje de los individuos se encontraban en estadio de crecimiento y en estadio maduro, sólo unos pocos desovaron. En el tratamiento de temperatura elevada (17 °C) un gran porcentaje de los organismos se encontraban en fase de crecimiento y sólo unos pocos en premaduro y desove (Figura 3A).

Fig. 3 Fig. 3 Frecuencia relativa de los estadios gonadales de hembras (A) y machos (B) de Arbacia dufresnii en las diferentes temperaturas y en las poblaciones Inicio y Final. Relative frequency of the gonadal stages of females (A) and males (B) of Arbacia dufresnii at different temperatures and in the Start and End populations. 

Los machos en el tratamiento de menor temperatura (13 °C) presentaron predominancia de solamente dos estadios, crecimiento y premaduros y en menor proporción intergaméticos. En el tratamiento de temperatura: 15 °C los estadios de los machos fueron homogéneos, la mitad se encontraban en el estadio premaduro y la otra mitad en crecimiento. En cambio, en el tratamiento de temperatura elevada (17 °C) el mayor porcentaje de los organismos se encontraban en fase de crecimiento y sólo unos pocos en premaduro y desove al igual que las hembras (Figura 3B).

Discusión

Los erizos de mar Arbacia dufresnii expuestos durante un período de ocho semanas a condiciones controladas con temperaturas mayores a su ambiente, mostraron variaciones en la morfología y reproducción respecto a individuos de la población natural. La temperatura influiría sobre diferentes parámetros fisiológicos de los organismos, expresados en variaciones en el diámetro, producción gonadal y peso del intestino. Sin embargo, el peso del organismo completo y de las estructuras calcificadas (linterna de Aristóteles y caparazón) no difirieron entre tratamientos. En Strongylocentrotus intermedius se encontraron resultados similares; es decir, no se observó efecto de la temperatura en individuos expuestos en tiempos de seis semanas a cuatro meses, sin embargo, sí se observó en individuos expuestos durante diez meses (^{Zhao et al., 2018}). De esta forma, en el presente trabajo se corroboró que el tiempo de respuesta de los diferentes órganos depende del tiempo del estímulo y la función y naturaleza de este. Órganos como la linterna de Aristóteles y el caparazón suelen mostrar respuestas a cambios ambientales de forma gradual (^{Lawrence & Ellwood, 1991}), mientras que los órganos de metabolismo más rápido y de funciones de obtención y almacenamiento de energía (como gónadas e intestino) muestran respuestas más rápidas (^{Russell, 1998}; ^{Rubilar et al., 2016}).

Al analizar la mortalidad durante el experimento, se observó que la temperatura afectaría el porcentaje de supervivencia dado que los tratamientos de mayor temperatura presentaron los valores más altos de mortalidad (duplicando al control). En otras especies como Strongylocentrotus franciscanus, Arbacia lixula, Heliocidaris erythrogramma, S. intermedius la mortalidad también es afectada por la temperatura en experimentos de laboratorio (^{Hernández et al., 2004}; ^{Harianto, Nguyen, Holmes & Byrne, 2018}; ^{Sastre-Perelló, 2018}; ^{Zhao et al., 2018}). En este trabajo, A. dufresnii presentó similar deterioro que el descripto por ^{Sastre-Perelló (2018}) en A. lixula expuesto a diferentes tratamientos de temperatura, donde los individuos parecen estar enfermos, mostrando un deterioro de la epidermis y del sistema ambulacral, resultando en necrosis epidérmica y la liberación de espinas, dando lugar finalmente a la muerte del individuo. A su vez, al finalizar el experimento y proceder a la disección, los individuos a 17 °C parecían presentar caparazones frágiles (observación personal). En el erizo Paracentrotus lividus la temperatura afecta el grosor del caparazón y en consecuencia su fragilidad (^{Byrne & Przeslawski, 2013}). Si bien en el presente trabajo no se realizaron mediciones de dureza y/o grosor, como así tampoco de composición mineral del caparazón, estos parámetros serían de gran importancia para aportar al conocimiento de la fragilidad del caparazón y su relación con el aumento de la temperatura. Por otro lado, el incremento de la temperatura del agua de mar no sólo tiene un efecto directo sobre el organismo, sino uno indirecto dado que también modifica otros factores en su ambiente, como acelerar los procesos bacterianos (^{White, Kalff, Rasmussen & Gasol, 1991}), favoreciendo las infecciones por bacterias patógenas transmitidas por el agua, dando como resultado eventos de mortalidad (^{Lessios et al., 1984}; ^{Hendler, 2013}; ^{Clemente et al., 2014}). Probablemente, en este experimento, tanto las heces como los restos de comida hayan producido una mayor carga orgánica, que no haya podido ser totalmente eliminada por los filtros utilizados, y por consiguiente de nutrientes nocivos para los organismos como los compuestos nitrogenados y los fosfatos (^{Avnimelech, 2006}). El incremento de estos compuestos afectan negativamente la fisiología de los organismos, disminuyen las defensas e incrementan la mortalidad de éstos (^{Böttger, McClintock & Klinger, 2001}; ^{Siikavuopio et al., 2008}; ^{Böttger & McClintock, 2009}). Cabe destacar que variables como oxígeno disuelto así como pH no fueron medidas durante el experimento, estas variables pueden también pueden contribuir en sinergia con la temperatura sobre la mortalidad. De esta forma es difícil poder concluir que la alta mortalidad se debió únicamente a la temperatura del agua.

El incremento del diámetro del caparazón fue mayor en los individuos expuestos al tratamiento térmico de 15 °C para ambos sexos. En términos absolutos, el incremento fue de 0.022 mm/d similar a lo encontrado por ^{Rubilar et al. (2016}) en condiciones de laboratorio. Si bien no se observaron diferencias en el incremento del peso total de los erizos de mar expuestos a los diferentes tratamientos, el peso seco de los órganos internos presentó diferencias. Tanto en el peso seco del intestino como en el de las gónadas, se observó un aumento de peso relacionado con el efecto de la temperatura, los valores más altos se observaron en el tratamiento de temperatura intermedia (15 °C). En los erizos de mar, el sistema digestivo es un sistema de órganos conformado por la faringe, el esófago, el sifón, el estómago, el intestino y el ano (^{Holland, 2013}), y comúnmente se llama intestino (“gut”, en inglés) al conjunto conformado por el estómago, el intestino y ano; donde el almacenamiento de nutrientes suple la necesidad metabólica a corto plazo (^{Lawrence, Lawrence, & Giese, 1966}; ^{Fenaux, Malara, Cellario, Charra & Palazzoli, 1977}; ^{Bishop & Watts, 1992}; ^{Hughes, Kelly, Barnes, Catarino, & Black, 2006}). En el intestino de A. dufresnii, se observaron mayores valores de carbohidratos que lípidos en su composición bioquímica evidenciando el rol de almacenamiento de nutrientes (^{Epherra, 2010}). El efecto de la temperatura sobre el peso intestinal se ha observado en Lytechinus variegatus; S. intermedius, P. lividus y A. lixula, reduciéndose probablemente la capacidad de almacenamiento de nutrientes (^{Watts et al., 2011}; ^{Sastre-Perelló, 2018}; ^{Zhao et al., 2018}). Por su lado, las gónadas cumplen un doble rol, puesto que generan gametos y almacenan nutrientes a más largo plazo que el intestino (^{Walker, 1982}; ^{Hughes et al., 2006}; ^{Walker, Lesser & Unuma, 2013}). En A. dufresnii las gónadas poseen altos valores de proteínas, seguidos por lípidos y en menor medida valores de carbohidratos, evidenciando un rol de almacenamiento (^{Parra et al., 2015}). Para poder analizar el aumento de peso encontrado tanto en las gónadas e intestino en este experimento es importante considerar el momento del año en que se realizó el experimento. Durante el otoño, A. dufresnii en el sitio estudiado comienza la gametogénesis, la maduración sucede en el invierno y el desove comienza con la primavera y se prolonga durante el verano (^{Brogger et al., 2010}; ^{Epherra et al., 2015}), es decir, durante el otoño los erizos de mar invierten gran cantidad de energía en la producción de gametas. El peso de los intestinos a 15 °C fue similar a los encontrados por ^{Rubilar et al. (2016}), posiblemente la alimentación y la asimilación en esta temperatura fue mayor que en los otros tratamientos, pudiendo llevar a cabo ambos procesos metabólicos. Este resultado es relevante dado que una buena condición nutricional en la progenie materna probablemente genere descendencia en mejores condiciones (^{Byrne et al, 2008}).

La gametogénesis de A. dufresnii coincide con una disminución de la temperatura del agua de mar en el ambiente natural y el cambio en el fotoperíodo (^{Brogger et al., 2010}; ^{Kino, 2010}; ^{Epherra et al., 2015}). Al comienzo del experimento, se corroboró que los organismos de ambos sexos se encontraban principalmente en el estadio previo a la gametogénesis, en el estadio pregamético. Los resultados obtenidos indican que tanto la temperatura como el sexo influencian en el peso seco de las gónadas y que estos factores interaccionan entre sí, dado que el peso seco de las gónadas fue mayor y, a su vez, los machos presentaron gónadas de mayor tamaño. La diferencia encontrada entre los sexos es un carácter de esta especie (^{Brogger et al., 2010}; ^{Epherra et al., 2015}; ^{Parra et al., 2015}; ^{Rubilar et al., 2016}; ^{Zárate, Díaz de Vivar, Avaro, Epherra & Sewell, 2016}). Tanto en el diámetro como en el peso seco del intestino, la producción gonadal fue mayor a 15 °C. Paracentrotus lividus presentó un resultado similar, favoreciéndose con un aumento de temperatura intermedio (^{Santos et al., 2020}). Los experimentos a temperaturas elevadas del agua de mar en otros equinoideos han mostrado la disminución de la producción gonadal (^{Siikavuopio et al., 2008}; ^{Delorme & Sewell, 2016}; ^{Johnstone, Nash, Hernández & Rahman, 2019}; ^{Gouda & Agatsuma, 2020}), lo cual ha sido asociado a una mayor demanda de energía del metabolismo (^{Uthicke et al., 2014}). Experimentos que combinan un aumento de temperatura junto con mayores niveles de CO₂ en el agua de mar han demostrado que Echinometra sp. A expuestos a estas condiciones presentan mayor actividad metabólica (medida como respiración), menor peso gonadal y que las gónadas tenían menos gametas maduras (^{Uthicke et al., 2014}).

Las diferencias encontradas entre los tratamientos térmicos están en directa relación con composición celular, es decir, el estadio gonadal. En A. punculata, la producción de gametos de machos y hembras muestra una relación negativa con temperaturas más altas del agua (^{Johnstone et al., 2019}). Mientras que en P. lividus, el tratamiento térmico que presentó mayor producción gonadal también promovió los niveles más altos de maduración de las gónadas (^{Santos et al., 2020}). En este trabajo, A. dufresnii mostró que en el tratamiento de temperatura intermedia además de presentar la mayor producción gonadal, los estadios gametogénicos que presentaron fueron similares a los encontrados en la población natural, si bien hay diferencias entre sexos.

Los machos en la población natural, en el mes de julio, se encuentran en estados de crecimiento y premaduración, es decir, que el epitelio germinal está en actividad y que hay presencia de espermatozoides maduros en las gónadas (^{Epherra et al., 2015}). Al comparar los tratamientos, podemos ver que a 13 °C y 15 °C el escenario es similar. Sin embargo, a 17 °C los individuos también estaban generando gametas y con presencia de espermatozoides pero ya se encontraban individuos desovando, lo cual coincide con los resultados de ^{Uthicke et al. (2014}) donde a mayor temperatura las gónadas de los erizos presentan menor cantidad de gametas maduras.

Por su lado, en la población natural las hembras suelen estar en el estadio premaduro y crecimiento al finalizar el experimento (julio). En el experimento, a 13 °C las gónadas de las hembras presentaron variedad de estadios. El 50 % de los individuos estaban en el estadio que se hubiera esperado, crecimiento y premaduro, sin embargo un 30 % se encontraba maduro o desovando y solamente una hembra se encontraba en intergamético. La variabilidad encontrada en hembras a esta temperatura es intrigante, pero a su vez podría relacionarse con el mayor costo energético que requiere la oogenesis (formación de gametas femeninas). Asumiendo que esta temperatura era la más cercana a la promediada para el ambiente natural durante los meses que duró el experimento, se esperaría que sean casi iguales a los estadios encontrados en la población natural, como sucede en machos. Para explicar esta condición se pueden plantear algunas hipótesis. Se sabe que la gametogénesis en hembras es mucho más demandante desde el punto de vista energético que en machos (^{Walker et al., 2013}), que cuando los erizos de mar se encuentran con baja disponibilidad de comida los estadios gonadales tienden a no ser homogéneos entre los individuos, y además de depender de factores como la temperatura y el fotoperiodo, también dependen de sus propias reservas energéticas (^{Lawrence, Lawrence & Watts, 2013}; ^{Rubilar et al., 2016}). Por lo tanto, es posible que las hembras no hayan ingerido comida suficiente, dado que la temperatura es el factor que más afecta el consumo de alimento y por lo tanto la energía obtenida (^{James, Siikavuopio & Mortensen, 2015}). En Strongylocentrotus droebachiensis la tasa de alimentación aumenta con la temperatura casi en una relación lineal en experimentos de laboratorio (^{Siikavuopio, Christiansen & Dale, 2006}). En cambio, en el ambiente natural, la relación no es lineal pero está fuertemente relacionada a la temperatura y el ciclo reproductivo que depende del fotoperiodo (^{Scheibling & Hatcher, 2007}). Durante el experimento, las hembras encontradas en estadios de desove comieron la mitad de las veces que lo hicieron las hembras en estadio de crecimiento, premaduro y maduro; y a su vez, el individuo en estadio intergamético comió una sola vez durante todo el experimento. Probablemente, la menor ingestión de alimento podría ser la causa de la composición celular de las gónadas las cuales no se encontraron en crecimiento. Sin embargo, los vínculos subyacentes entre la ingesta de alimento y el ciclo reproductivo aún no están claros (^{James et al., 2015}). Estudios de laboratorio mostraron una completa falta de respuesta en la ingesta de alimento por parte de los erizos de mar cuando se exponen a condiciones de mantenimiento subóptimas (^{Siikavuopio, 2009}). A todos los individuos del experimento se les ofreció alimento ad libitum, de esta forma los resultados observados en hembras en la temperatura 13 °C pudiesen atribuírse a condiciones de mantenimiento subóptimas. Por su lado, en el tratamiento de 17 °C las hembras se comportaron de forma análoga a los machos; y a 15 °C, en cambio, ya hay presencia de individuos maduros y desove, aún no registrado en el ambiente natural para este periodo otoñal.

Como conclusión de este estudio, se encontró que en el tratamiento de 15 °C, los individuos de A. dufresnii, presentaron cambios favorables en el incremento en el diámetro, producción gonadal así como también un aumento en el peso del intestino a pesar de registrarse una relativa alta mortalidad. De los tres tratamientos ensayados, esta es la temperatura óptima para el desarrollo y crecimiento de estos organismos en las condiciones experimentales probadas, si bien presentó una mortalidad mayor que a 13 °C.

Finalmente, si bien el océano irá cambiando más gradualmente su temperatura durante las próximas décadas, es probable que muchas especies puedan tolerar cambios futuros mediante la aclimatación o la adaptación. Sin embargo, existen pocos estudios de tolerancia térmica en donde se evalúe a los erizos de mar adultos en el contexto del cambio climático global. Por lo tanto, el presente trabajo permitiría sentar las bases de los efectos de la temperatura en la población de A. dufresnii en el Golfo Nuevo. Por otra parte, se requeriría de más trabajos donde se consideren los efectos de las interacciones sinérgicas entre muchos factores antropogénicos, como la mayor radiación UV (debido a la ruptura de la capa de ozono), la contaminación y la acidificación de los océanos para predecir mejor los cambios futuros en la estructura de los ecosistemas. Para comprender completamente las consecuencias biológicas del cambio climático, múltiples variables climáticas deben ser manipuladas experimentalmente en conjunto.

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