Introducción
Hypericum pertenece a la familia Hypericaceae y comprende aproximadamente 469 especies de hierbas, árboles y arbustos distribuidos en todos los climas templados del mundo; sin embargo, en los trópicos sólo están presentes en el rango altitudinal comprendido entre 1 900 y 3 600 msnm (Ernst, 2003). Actualmente las especies de Hypericum se agrupan en 36 secciones de acuerdo con su morfología, distribución y citología (Nürk, 2011). La mayoría de las especies nativas de regiones montañosas de Centroamérica y Sudamérica forman parte integral del tipo de vegetación de páramo y subpáramo, y pertenecen a la sección Brathys (Crockett, Eberhardt, Kunert, & Schübly, 2010), destacándose en Colombia las especies H. goyanesii, H. juniperinum, H. mexicanum y H. strictum (Marín & Parra, 2015). Hypericum posee una amplia diversidad de metabolitos que se asocian con múltiples efectos farmacológicos. Propiedades de tipo antidepresivo (hiperforina, adhiperforina y flavonoides), antiviral (hipericina y pseudohipericina), antiinflamatorio, espasmolítica (flavonoides) y antimicrobiano han sido descritas para especies de este género (Greeson, Sanford, & Monti, 2001; Ernst, 2003; Saddiqe, Naeem, & Maimoona, 2010; Stojanovic, Dordevic, & Smelcerovic, 2013). Los metabolitos a los que se les atribuye dichas actividades están almacenados en estructuras de secreción presentes, tanto en los órganos vegetativos como en los reproductivos (Perrone, De Rosa, De Castro, & Colombo, 2013), y dentro de tales metabolitos se encuentran hipericina e hiperforina, que presentan un rol defensivo, aumentando sus niveles después del ataque de herbívoros generalistas (Sirvent, Krasnoff, & Gibson, 2003).
Debido a la importancia taxonómica de las estructuras de secreción presentes en el género, Green (1884) realizó una revisión de las descripciones anatómicas de Hypericum y la complementó con observaciones de Hypericum calycinum, H. tetrapterum, H. hyrsutum, y H. perforatum, encontrando que hay cuatro tipos de estructuras secretoras: (1) cavidades lisígenas, translúcidas con aceites, (2) canales de resina densos, en corteza y médula, (3) canales esquizógenos delgados en el floema y (4) nódulos o glándulas negras en hojas y flores.
Posteriormente se ha establecido que el origen de todas las estructuras secretoras de este género es esquizógeno; por lo tanto, estas categorías han sido revaluadas. En este contexto, Curtis y Lersten (1990) describen que en las hojas y flores de H. perforatum y H. balearicum existen cavidades esquizógenas con aceite y glándulas negras, definidas como nódulos carentes de espacios intercelulares, rodeados por una vaina de células aplanadas, que no presentan contenido resinoso. Ciccarelli, Andreucci y Pagni (2001a y 2001b) y Lotocka y Osinska (2010) definen finalmente, tres estructuras de secreción: las glándulas translúcidas, las glándulas negras y los canales secretores, que pueden ser de tres tipos A, B y C.
H. juniperinum, es conocido comúnmente como chite o guardarocio y tradicionalmente se emplean las flores para tratar la tos y las ramas para hacer escobas o fuego (Duarte & Parra, 2015). Recientemente se han detectado en esta especie flavonoides y compuestos fenólicos y se ha reportado actividad de tipo antidepresivo del extracto metanólico y las fracciones de acetato de etilo y butanol en ratones (Mejía- Agudelo et al., 2019). En esta investigación se realizó el estudio morfoanatómico e histoquímico de H. Juniperum con el fin de relacionar los metabolitos producidos con las estructuras anatómicas presentes en los órganos vegetativos y reproductivos La descripción realizada aquí puede ser empleada para elaborar una monografía de esta especie andina.
Materiales y métodos
Material vegetal: Los órganos aéreos (tallos, hojas y flores) de Hypericum juniperinum (Kunth) fueron recolectados en la vereda Arbolocos del municipio de Cuítiva, Boyacá, Colombia. Un ejemplar fue depositado en el Herbario Nacional Colombiano (COL) con código 589611.
Histología de los órganos aéreos: Los órganos aéreos (tallos, hojas y flores) de Hypericum juniperinum fueron fijados en una solución de FAA (10:5:85, formol: ácido acético: etanol 70 %) por 48 h y posteriormente fueron tratados con los protocolos convencionales de Johansen (1940) modificados, siguiendo la metodología descrita por Robles, Raz y Marquínez (2016). Al final se adicionó citoresina sobre los portaobjetos, se montó el cubreobjetos y se dejó secar al aire durante 2 semanas. Adicionalmente, la descripción de las estructuras secretoras de esta especie se realizó de acuerdo a Ciccarelli et al., (2001a).
Histoquímica de los órganos aéreos: Se seccionaron a mano alzada tallos, hojas y flores recién recolectados de H. Juniperinum y se realizaron tinciones histoquímicas diferenciales: Fluoroglucinol-HCl para lignina, rojo de rutenio para pectinas, Sudán III, IV y Sudán negro para grasas, aceites, suberina y cutina (Ruzin, 1999), reactivo de Dragendorff para alcaloides (Brechu-Franco, Laguna-Hernández, De-la-Cruz-Chacón, & González-Esquinca, 2016) y cloruro férrico para compuestos fenólicos (Texeira & Monteiro, 2017). En todas las pruebas se compararon las tinciones con una sección no teñida (blanco), con el fin de descartar falsos positivos.
Fotografía y procesamiento de imágenes: El material fresco, las tinciones histoquímicas y los micropreparados fueron observados y fotografiados utilizando un estereoscopio Leica M-205 en modo multifocus con cámara MC170HD, y un microscopio Olympus BX50 con cámara Moticam-pro 28. Las imágenes digitales fueron procesadas con los programas Adobe Photoshop CC y Adobe Indesign.
Resultados
Descripción general: Hypericum juniperinum es un arbusto con hojas sésiles, erectas e imbricadas, la lámina foliar es acicular y con ápice agudo, con glándulas redondeadas visibles a simple vista (Fig. 1A). Las flores son terminales, agrupadas en pares y conformadas por cuatro verticilos: cáliz conformado por cinco sépalos verdes lanceolados y libres, corola con cinco pétalos libres, oblongos y de color amarillo intenso, androceo con aproximadamente 21 estambres fasciculados, agrupados en grupos de 4-5 estambres de color amarillo y filamentos alargados, y gineceo ovoide, sincárpico, tricarpelar, trilocular en la base y unilocular en el ápice, donde se localizan 3 a 5 estilos que rematan en estigmas glandulares y con forma de cabezuela (Fig. 1B).
Anatomía e histoquímica del tallo: Se estudiaron tallos jóvenes (Fig. 1C) y maduros (Fig. 1D). En tallos maduros se presenta un súber prominente, compuesto por varias capas de células rectangulares, con paredes gruesas suberificadas y contenido de color café, felógeno uniestratificado. En todos los tallos se observa una delgada corteza parenquimática conformada con células de contenido variable. En la corteza y el floema se presentan ductos rodeados por cuatro a cinco células secretoras (cnA: canales tipo A) (Fig. 1C). El floema presenta radios unicelulares dilatados, alternados con agrupaciones de elementos de tubo criboso y células acompañantes de tamaño pequeño, la zona cambial se reduce a dos o tres capas de células. El xilema presenta radios unicelulares o rara vez bicelulares, conformados por parénquima lignificado, entre los radios se presentan grandes vasos, sin contenido y de paredes más delgadas, uniperforados y con punteaduras reticuladas en sección longitudinal. El parénquima paratraqueal presenta contenido denso y en algunos casos oleoso, las fibras son escasas. No se observaron anillos de crecimiento (Fig. 1E).
En el análisis histoquímico, Sudán III, IV y negro reaccionan con la suberina del tallo y con aceites presentes en los canales de corteza y floema, dando una coloración roja para las dos primeras tinciones (Fig. 1F) y negra en la última (Fig. 1G). El cloruro férrico genera una coloración negra continua en el floema y en la médula del tallo asociada a la presencia de sustancias de tipo fenólico (Fig. 1H). La tinción con fluoroglucinol ácido genera una coloración rosada-roja intensa en el xilema del tallo, siendo positiva para paredes lignificadas (Fig. 1I). La prueba de Dragendorff fue negativa, lo que indica ausencia de alcaloides. La prueba con rojo de rutenio indica la presencia ocasional de pectinas en células del xilema.
Hoja: Las hojas de H. juniperinum se encuentran dispuestas alternamente en forma de roseta. Presentan una epidermis conformada por células de recubrimiento redondeadas con cutícula externa gruesa y estomas en la cara adaxial (hoja epistomática) y de tipo anomocítico (Fig. 1J, Fig. 1K), no se observaron tricomas. El mesófilo está conformado en su mayor parte por dos capas de parénquima en empalizada, tanto en la superficie adaxial como abaxial, en el centro se presenta un parénquima más laxo (esponjoso) entre el haz vascular central mayor y los dos haces menores. Los haces están rodeados de una vaina con contenido tanífero (Fig. 1L), adicionalmente la lámina foliar presenta canales esquizógenos de tipo B rodeados por 8-12 células de parénquima secretor (Fig. 1J).
En la evaluación histoquímica se observan sustancias de carácter lipídico en la cutícula de la epidermis, al interior de los canales esquizógenos y en algunas células parenquimáticas; reveladas por las pruebas con el reactivo de Sudán (Fig. 2A). La prueba de cloruro férrico generó una coloración negra distribuida en todos los tejidos de la hoja, exceptuando los canales, evidenciando sustancias de tipo fenólico. El fluoroglucinol revela únicamente la lignina del xilema en los haces vasculares (Fig. 2B), no se presenta esclerénquima extraxilar. Los tejidos secretores que rodean los canales y los tejidos de la vaina y del parénquima alrededor de los haces vasculares están reforzados con pectinas (tejidos colenquimáticos) de acuerdo con la tinción con rojo de rutenio (Fig. 2C). No se observó la presencia de alcaloides en la hoja de acuerdo con la prueba de Dragendorff.
Flor: El corte transversal del cáliz y corola muestra una epidermis uniestratificada, caracterizada por células de recubrimiento redondeadas de tamaños similares, sin estomas, ni tricomas. El mesófilo presenta varias capas de células del parénquima isodiamétricas, entre las cuales se observan los haces vasculares, uno central en sépalos y tres en pétalos. En cáliz y corola se presentan canales secretores de tipo A y tamaño menor a los de las hojas. (Fig. 2J).
El filamento de los estambres presenta una epidermis uniestratificada, parénquima laxo y un haz vascular central (Fig. 2G). Las anteras son basifijas, presentan un exotecio (epidermis) uniestratificado, con contenido denso y oscuro, el endotecio uniestratificado es fibroso y está formado por células cuadrangulares, una capa muy delgada de estratos intermedios y un tapetum con contenido denso que se degrada en la medida que se conforman los granos de polen (Fig. 2D). La pared del gineceo presenta una epidermis externa, sin estomas, ni tricomas, conformada por células de recubrimiento redondeadas y con contenido denso (tanífero), debajo de la epidermis externa se observaron canales secretores de tipo A, esquizógenos y abundantes, debajo de los cuales el mesófilo es parenquimático, tanífero y con haces vasculares inmersos (Fig. 2E). En la parte inferior del ovario los bordes carpelares se fusionan en el centro y se presentan numerosos haces vasculares y parénquima laxo. Cada lóculo presenta dos filas de óvulos anátropos, siendo la placentación axilar. Sin embargo, en la parte superior del ovario los lóculos se unen y la placentación aparenta ser parietal (Fig. 2F).
En el análisis histoquímico, las pruebas de Sudán indican la presencia de aceites en los canales del cáliz, corola y ovario; también tiñen el polen y el estigma (Fig. 2H, Fig. 2I, Fig. 2J). Externamente las anteras dieron reacción positiva para sustancias fenólicas (cloruro férrico) (Fig. 2L) y para aceites (Sudán black) (Fig. 2K). El fluoroglucinol produce una coloración rosada-roja intensa en el xilema de los haces vasculares. La prueba de Dragendorff fue negativa para alcaloides. Los resultados anteriormente mencionados se encuentran resumidos en el tabla 1.
Órgano de Hypericum juniperinum | Sudan IV y black | Cloruro férrico | Fluoroglucinol | Dragendorff | Rojo de rutenio |
TALLO | Reacción en corteza y floema | Reacción en médula y floema | Reacción con lignina del xilema | - | Pectinas en el xilema |
HOJA | Cutícula de epidermis, canales y parénquima | Reacción en todos los tejidos | Reacción en xilema del haz vascular | - | Parénquima alrededor del haz vascular |
FLOR | Canales, cáliz, corola, ovario, anteras y polen | Reacción en las anteras | Reacción en xilema del haz vascular | - | - |
Discusión
La estructura morfológica de los órganos de H. juniperinum debe entenderse en el contexto de las condiciones de vida en el páramo, de acuerdo con Mora-Osejo y Sturm (1995). En este trabajo los autores establecen las características que determinan xeromorfía o mesomorfía en 49 plantas de páramo, incluyendo Hypericum goyanesii, H. mexicanum y H. strictum. De acuerdo con estas características, H. juniperinum es altamente xeromórfica al presentar hojas cartáceas, arrosetadas, convolutas y en posición vertical, con parénquima en empalizada biestratificado, paredes engrosadas, cutícula gruesa y cera epicuticular en las dos epidermis foliares, estomas en la cara abaxial y con cámara epiestomática. Sin embargo, presenta algunas características mesomórficas como el haz conductor con vaina parenquimática (no esclerenquimática) y parénquima esponjoso laxo.
Al realizar una comparación entre especies europeas de Hypericum (H. perforatum, H. perfoliatum, H. tetrapterum, H. androsaemum y H. hircinum) con Hypericum juniperinum se observaron similitudes como, la presencia de hojas convexas en la cara adaxial, epidermis monoestratificada y glándulas de tamaño variable distribuidas en el mesófilo (Perrone et al., 2013). Sin embargo; también se aprecian diferencias, puesto que las especies europeas presentan hojas dorsiventrales (bifaciales sensu Mora-Osejo & Sturm, 1995) o isobilaterales (unifaciales sensu Mora-Osejo & Sturm 1995), en tanto que las especies de Hypericum del páramo son equifaciales (H. goyanessi, H. mexicanum y H. juniperinum) o dorsiventrales inversas en H. strictum.
En el tallo de Hypericum juniperinum la presencia y disposición de los canales secretores en el floema (tipo A), el parénquima con células taníferas, y el xilema con porosidad difusa es similar a lo establecido por Perrone et al., (2013) para otras especies de Hypericum; tales como H. pubescens y H. aegypticum. Al comparar los resultados del presente estudio con los reportados por Schweingruber, Börner y Schulze (2011) para 16 especies de Hypericum, se encuentra que H. juniperinum no genera anillos anuales, pero si presenta gotas de aceite (oil drops) y canales secretores en el floema, al igual que las especies de Hypericum analizadas.
Con referencia a las diferentes estructuras secretoras, Hypericum juniperinum presenta canales tipo A en el ovario de la flor, así como en el floema del tallo, similar al estudio de Lotocka y Osinska (2010), y canales tipo B en el mesófilo de la hoja; canales que han sido reportados en otras especies del género Hypericum. Bottega, Garbari y Pagni (2004), destacan en Hypericum elodes la existencia de tres tipos de canales diferentes a lo largo de la flor, dependiendo de su ontogenia: en el pedúnculo floral canales de tipo A, en los sépalos canales de tipo B y finalmente en la pared ovárica canales de tipo C. Adicionalmente, las pruebas histoquímicas realizadas para Hypericum juniperinum corroboran la presencia de metabolitos de tipo lipídico almacenados en estas estructuras.
Hypericum perforatum, especie ampliamente estudiada perteneciente a la sección Hypericum, presenta glándulas negras en hojas, flores y en mayor cantidad en los estambres (Zobayed, Freen, Goto, & Koza, 2006). Este tipo de glándulas fueron definidas ontogenéticamente por Ciccarelli et al., (2001b) como agrupamientos de células secretoras rodeadas por una vaina de células aplanadas que en su madurez se llenan de contenido, principalmente hipericina y pseudohipericina (Zobayed et al., 2006). En H. juniperinum no se aprecian estas estructuras. Adicionalmente, al utilizar cromatografía en capa delgada con reveladores específicos, se confirma la ausencia de estos metabolitos en el extracto metanólico de esta especie (Mejía-Agudelo, 2017), lo que coincide con la descripción realizada por Crockett y Robson (2011) para la sección Brathys a la que pertenece H. juniperinum.
Por otra parte, H. juniperinum si presenta glándulas translúcidas, estructuras secretoras características de todo el género (Robson, 1987). Según Ciccarelli et al., (2001a) indican que este tipo de glándulas se encuentran distribuidas en la hoja, sépalos y pétalos. Por otro lado, Soelberg, Jorgensen y Ger (2007) encontraron en H. perforatum, especie empleada para el tratamiento de la depresión, que estas glándulas sintetizan el metabolito hiperforina, junto con algunos aceites esenciales que comparten la misma ruta biosintética. En el presente trabajo, a través del empleo de tinciones con Sudán, se confirma la presencia de sustancias de carácter lipídico alojadas en estas estructuras y que son importantes para la defensa de la planta frente a herbivoría (Ciccarelli et al., 2001a). Dicha defensa se da mediante la biosíntesis y almacenamiento de lípidos no volátiles, que están involucrados en la reducción de la alimentación por parte de los insectos o en la disrupción de los procesos de crecimiento de los mismos (Seigler, 1983).
El estudio histoquímico y anatómico permitió detectar ciertos metabolitos como aceites, fenoles y lignina en los tejidos de H. juniperinum. Adicionalmente no se detectaron alcaloides, lo que coincide con la revisión realizada por Crockett y Robson (2011). Por otro lado, lo referido en el análisis histoquímico concuerda con el trabajo realizado por Plazas (2017), que encontró que los metabolitos presentes en el extracto de Hypericum juniperinum son terpenos, esteroides, fenoles, taninos, flavonoides, quinonas y cumarinas, careciendo de glicósidos cardiotónicos y alcaloides. Lo anterior, junto con el artículo publicado por Mejía et al. (2019); permite una caracterización especifica de los flavonoides y sustancias fenólicas encontradas en los extractos de esta planta de interés medicinal encontrada en los páramos colombianos.
El presente trabajo es el primer reporte de las principales características anatómicas e histoquímicas de Hypericum juniperinum. En conclusión, las características anatómicas principales en las hojas de H. juniperinum, la disposición en roseta, la presencia de glándulas translucidas, los estomas en la cara adaxial, vaina de contenido tanífero y canales de tipo B; en el tallo ductos con 4 a 5 células secretoras, floema con radios, vasos uniperforados y punteaduras reticuladas, y finalmente en la flor no hay presencia de tricomas, canales secretores tipo A en cáliz y gineceo. Los resultados obtenidos relacionan la anatomía y sus adaptaciones estructurales con el tipo de vida que H. juniperinum presenta; y la necesidad de estas para su supervivencia en el páramo. Adicionalmente, la descripción macro y microscópica brindada para hojas, tallos y flores, así como la ubicación específica de los metabolitos en los tejidos de H. juniperinum, proveen información clave para la caracterización y autentificación de esta especie andina que tiene el potencial de ser utilizada como materia prima en la elaboración de productos útiles para el tratamiento de trastornos mentales como la depresión.
Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de ningún tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. Todas las fuentes de financiamiento se detallan plena y claramente en la sección de agradecimientos. El respectivo documento legal firmado se encuentra en los archivos de la revista.