Las especies de Aeromonas son bacterias ubicuas de ecosistemas acuáticos, de morfología bacilar y Gram negativas, pueden ser mesófilas con movilidad o psicrófilas sin movilidad. Esta bacteria es considerada un patógeno entérico emergente que además se asocia a infecciones de heridas, en sistema hepatobiliar, tracto respiratorio, tejidos blandos y septicemia en humanos (Janda & Abbott, 2010; Figueras & Beaz-Hidalgo, 2015; Batra Mathur, & Misra, 2016).
El género Aeromonas posee una variedad de factores de virulencia como componentes estructurales y toxinas, además el género Aeromonas tiene la capacidad de capturar e integrar factores de virulencia en su genoma (Palma-Martínez et al., 2016) mismos que están involucrados en la colonización, invasión y proliferación de la bacteria conduciendo al desarrollo de la infección (Figueras & Beaz-Hidalgo, 2015; Batra et al., 2016). Las manifestaciones clínicas en infecciones por Aeromonas sugieren que múltiples factores de virulencia actúan en conjunto, por lo que la virulencia podría ser específica de cada cepa que interviene evadiendo el sistema inmunitario mediante sus propias estrategias (Yu et al., 2005; Tomás, 2012).
A pesar de que algunos estudios han demostrado enterotoxicidad de algunas cepas de Aeromonas, no se ha establecido como un agente etiológico, ya que Aeromonas forma parte de las bacterias de difícil identificación bioquímica y comúnmente confundida por el género Vibrio (Castro-Escarpulli et al., 2003) por lo que los datos epidemiológicos de infecciones asociadas con esta bacteria son escasos y aunado también a la carencia de un modelo animal establecido para reproducir las infecciones causadas por Aeromonas (Tomás, 2012). Sin embargo, en 2004, ocurrió un brote de diarrea en Brasil, con 2 170 casos, Aeromonas fue el patógeno aislado de 119 de 145 muestras. En 2012, en Brasil se reportó a Aeromonas en 2.7 % a partir de muestras diarreicas aislando a A. caviae más frecuentemente seguida de A. hydrophila (Prediger et al., 2012). Mientras que, Tsheten et al., 2016, en el reino asiático de Bután reportaron un brote por intoxicación alimentaria causado por el consumo de carne con A. hydrophila.
Cabe señalar que Aeromonas es un microorganismo que forma parte de la microbiota de los peces, y estos productos alimenticios son de los más comercializados a nivel mundial y más de la mitad del valor de las exportaciones pesqueras procede de países en desarrollo (FAO, 2016). La tilapia es una especie cuya demanda a nivel mundial ha incrementado desde 1970, siendo el segundo grupo de peces más importante (Fuentes, Valladares, Grass, & Pico, 2011). La presencia de Aeromonas en dichos productos puede causar enfermedades entéricas y por lo tanto son bacterias de interés para la salud pública, asimismo especies de Oreochromis spp. son endémicas en aguas del Río Bravo y canales que atraviesan la zona fronteriza de Reynosa, Tamaulipas. Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue identificar genes de virulencia presentes en cepas de Aeromonas aisladas en Oreochromis spp. destinado a consumo humano en Reynosa, Tamaulipas, México.
Materiales y métodos
Cepas de Aeromonas: En este estudio fueron analizadas 15 cepas de Aeromonas procedentes de un cepario del Laboratorio de Biotecnología Genómica del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional, dichas cepas fueron aisladas a partir de Oreochromis spp. destinadas a consumo humano y obtenidas entre junio y octubre de 2016 en aguas del Río Bravo y canales Rodhe y Anzaldúas que atraviesan la ciudad de Reynosa, Tamaulipas, México.
Identificación preliminar: a partir de las cepas almacenadas en glicerol al 85 % a -70 °C, se tomaron 20 μl y se inocularon en Agar Aeromonas, incubando a 37° C por 18 h para comprobar la pureza. Posteriormente, se procedió a realizar la identificación preliminar para lo cual las colonias típicas fueron sembradas en Agar Luria Bertani (IBI SCIENTIFIC) para después realizar las pruebas de tinción de Gram; actividad citocromo-c-oxidasa; actividad catalasa; oxidación-fermentación de la glucosa y hemolisis.
Identificación molecular: Se corroboró molecularmente la identidad de las cepas a través PCR del gen gyrB y secuenciación. Para lo cual las cepas bacterianas fueron inoculadas en caldo LB a 37 °C por 24 h. El ADN genómico se extrajo con el kit Promega Wizard® Genomic Ref. A1120. Posteriormente se realizó una PCR del gen gyrB utilizando las condiciones reportadas por Sánchez-Varela, Ortega-Balleza, Rodríguez-Luna y Guo (2018) los productos obtenidos correspondían a 967 pb los cuales fueron secuenciados en el equipo ABI®3130 Genetic Analyzer, después las secuencias fueron analizadas en BLAST del NCBI para corroborar la especie a la cuál pertenecían. Se utilizaron como referencia las cepas Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966, E. coli O157:H7 y E. coli K12.
Detección de genes de virulencia por Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR): La PCR de los genes de virulencia (alt, ast, aerA, hlyA, gcat y stx1) se realizó a partir del ADNg extraído de las cepas de Aeromonas spp. Los iniciadores que se utilizaron se indican en el Cuadro 1. La PCR se realizó a volumen final de 25 μl; en cada tubo de reacción se colocó 1μl ADN genómico (concentración promedio de 100-200 ng/μl), 5μl de solución amortiguadora 1X, 0.75 μl de MgCl2 1.5 mM, 0.5μl dNTPs 0.05 mM, 0.5 μl de iniciadores 0.1 μM (Cuadro 1) y 1.25 U/μl de Taq polimerasa y 19 μl de agua milli-Q estéril. La reacción se realizó en un termociclador Veriti® de Applied Biosystems, bajo las siguientes condiciones: 95 °C por 2 min, enseguida 30 ciclos a 95 °C por 30 seg, la temperatura de alineamiento de cada uno de los iniciadores se muestra en el cuadro 1, extensión a 72°C por 1.50 min, y finalizar a 72 °C por 10 min. Los productos resultantes fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5 % en solución amortiguadora de Tris Borato EDTA, pH 8 (TBE 1X), durante 1 h a 90 Volts. Después el gel fue visualizado en un fotodocumentador Kodak® con cámara Gel Logic 112.
Gen | Secuencia (5’-3’) | Tamaño (pb) | Tm (°C) | Referencia |
---|---|---|---|---|
alt-F alt-R | tga ccc agt cct ggc acg gc ggt gat cga tca cca cca gc | 442 | 64 | Nawaz et al., 2010 |
ast-F ast-R | atc gtc agc gac agc ttc tt ctc atc cct tgg ctt gtt gt | 504 | 60 | Aguilera-Arreola et al., 2005 |
aer-F aer-R | cct atg gcc tga gcg aga ag cca gtt cca gtc cca cca ct | 431 | 64 | Soler et al., 2002 |
hlyAF hlyAR | cca cgc aaa ttc atc acg atc ctt gtt cac ctc gac | 1079 | 57 | Abdullah et al., 2003 |
gcat-F gcat-R | ctc ctg gaa tcc caa gta tca g ggc agg ttg aac agc agt atc t | 237 | 62 | Soler et al., 2002 |
stx1F stx1R | agc agt cat tac ata aga ac tgg att taa tgt cgc ata g | 144 | 53 | Hernández-Cortez et al., 2013 |
Análisis estadístico: Los datos se analizaron usando el programa IBM® SPSS® Statistics versión 22 (SPSS Inc., Chicago, IL). La distribución de los genes de virulencia entre las especies de Aeromonas obtenidas se realizó mediante la prueba exacta de Fisher. Un valor de P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
La identificación a nivel de especie mostró que, del total de cepas, 12 correspondían a A. veronii, dos a A. hydrophila y una correspondió a A. schubertii. La identificación molecular de los genes de virulencia mostró que el 100 % de las cepas de Aeromonas presentó al menos un gen de virulencia (Cuadro 2). El gen aerA se presentó en el 86.66 % (13/15) y fue el más común. El gen gcat se detectó en 53.33 % (8/13) de Aeromonas. Mientras que los genes alt y hlyA fueron identificados en 40.0 (6/15) y 6.66 % (1/15) de las cepas. Por otra parte, tanto el gen ast como stx1 no fueron identificados en este estudio. No hubo diferencias significativas entre la distribución de los genes alt, ast, aerA, hlyA, gcat y stx1, y las tres especies detectadas (P > 0.05).
Cepa / Gen de virulencia | A. veronii (n = 12) | A. hydrophila (n = 2) | A. schubertii (n = 1) | Total (n = 15) |
---|---|---|---|---|
alt | 4 | 2 | 0 | 6 |
ast | 0 | 0 | 0 | 0 |
aerA | 10 | 2 | 1 | 13 |
hlyA | 0 | 1 | 0 | 1 |
gcat | 6 | 2 | 0 | 8 |
stx1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Asimismo, diferentes especies de Aeromonas llevan conjuntos distintos de genes de virulencia estudiados. En total se obtuvo que 53.33 % de Aeromonas presentaron más de un gen asociado en una misma cepa. En A. veronii se presentó prevalentemente aerA/gcat en 50.0 % (3/6), alt/aerA 16.66 % (1/6) y alt/aerA/gcat en 33.33 % (2/6); mientras que en las dos cepas de A. hydrophila se observó tanto alt/aerA/gcat/ hlyA como alt/aerA/gcat. Sin embargo, en A. schubertii no fue detectada ninguna asociación.
Discusión
Varios estudios han establecido un vínculo epidemiológico entre las fuentes de infección y los aislados clínicos de Aeromonas spp. (Hoel, Vadstein, & Jakobsen, 2017), estudiar la composición bacteriana de productos alimenticios acuícolas es de vital importancia para evaluar la seguridad, riesgo de exposición a patógenos humanos y la adopción de medidas de control destinadas a disminuir la propagación de posibles bacterias patógenas (GrandeBurgos et al., 2018), ya que las enfermedades de transmisión alimentaria son un problema de salud mundial principalmente en países en vías de desarrollo (Tsheten et al., 2016).
Por otra parte, aunque el potencial de virulencia y los mecanismos patogénicos del género Aeromonas aún no están claros (Silva et al., 2017), se han estudiado factores de virulencia relacionados con la patogenicidad de la bacteria como estructuras y enzimas extracelulares, descritas principalmente en A. hydrophila (Castro-Escarpulli et al., 2002; Suárez & Herrera, 2012) con la capacidad de dañar los tejidos del huésped y evadir su defensa inmune (Figueras & Beaz-Hidalgo, 2015).
En este estudio, el gen aerA estuvo presente en mayor porcentaje (80 %) en las cepas analizadas, principalmente en A. veronii. A pesar de que esta enterotoxina es común en cepas clínicas de Aeromonas, estudios han mostrado que cepas ambientales también poseen dicho gen encontrándose en más del 80 % de las cepas, las cepas analizadas en este trabajo proceden Oreochromis spp. de agua dulce, en dicha fuente este gen suele ser más prevalente (Ottaviani et al., 2011; Igbinosa & Okoh, 2013; Abu-Elala, Abdelsalam, Marouf, & Setta, 2015). El gen aerA se presentó en A. veronii, A. hydrophila y A. shubertii que están asociadas a procesos infecciosos ya que la aerolisina (AerA), tiene actividad hemolítica y citotóxica, y causa daño extenso al epitelio (Chopra & Houston, 1999).
Las lipasas son consideradas de importancia para la nutrición bacteriana, además de actuar como factores de virulencia (Onuk et al., 2013) y participar en la patogénesis en A. salmonicida (Chacón, Figueras, CastroEscarpulli, Soler, & Guarro, 2003). En México, a partir de tilapia comercializada (Oreochromis niloticus niloticus) gcat estuvo presente en todos los aislados analizados (Castro-Escarpulli et al., 2003). En Turquía, 2013, se obtuvo 36.6 % de gcat a partir de aislados procedentes de pescado y agua superficial (Onuk et al., 2013), mientras que, los resultados obtenidos en este trabajo señalan que en 53.33 % de las cepas evaluadas se detectó dicho gen, presentándose en A. veronii y A. hydrophila, cepas de alta frecuencia de detección en infecciones, no obstante, se esperaría encontrar a dicho gen en todas las cepas evaluadas ya que se considera especifico del género Aeromonas y ha llegado a ser de utilidad en la identificación del género (Khor, Puah, Tan, Puthucheary, & Chua, 2015), en este estudio probablemente los cebadores empleados no son específicos para todas las cepas o estas presentan polimorfismos en esa región génica.
Por otra parte, en este estudio, el gen alt fue detectado tanto en A. veronii como A. hydrophila, otros trabajos también han reportado su presencia en diferentes especies (Ottaviani et al., 2011; Zhou et al., 2013), la enterotoxina citotónica termolábil (Alt) no provoca la degeneración de las criptas y las vellosidades intestinales, sin embargo, interviene en la aparición de diarrea secretora (Chopra & Houston, 1999). Además, cepas positivas para el gen alt están asociadas con la aparición de heces blandas (Pablos, Rodríguez-Calleja, Santos, Otero, & García-López, 2009). En este trabajo alt se detectó individualmente y también en asociación con otros genes incrementando la patogenicidad de Aeromonas, sin embargo, es importante destacar que, solo pueden expresarse en ciertas condiciones de crecimiento (Silva et al., 2017).
No se han encontrado reportes sobre la presencia de aerA/gcat en cepas de Aeromonas, cabe mencionar que tanto aerA como gcat son activados por serin proteasas (Aguilera-Arreola, Hernández-Rodríguez, Zúñiga, Figueras, & Castro-Escarpulli, 2005) además de otras enzimas extracelulares, contribuyendo y potenciando la virulencia de Aeromonas (Nawaz et al., 2010). Aguilera-Arreola et al., 2007 reportaron 6.4 % alt/aerA en cepas de A. veronii y A. caviae de España y México (Aguilera-Arreola et al., 2007) . Además, no se ha establecido la relación entre la presencia de genes de toxinas específicos y la presentación clínica de la enfermedad (Hoel et al., 2017). Las combinaciones encontradas pueden depender de la región donde sea aislada la bacteria ya que además estan sometidas a diferentes presiones ambientales.
La incidencia de Aeromonas en las heces de pacientes con diarrea ha incrementado en los últimos años. En 2015, diferentes especies de Aeromonas fueron recuperadas de heces pacientes con gastroenteritis o diarrea aguda en la Ciudad de México, presentándose en cuarto lugar sólo por debajo de E. coli enteropatógena, Shigella y Salmonella, y por encima de bacterias que en diferentes países son frecuentemente causantes de enfermedades diarreicas como Campylobacter jejuni o Vibrio spp. (NovoaFarías et al., 2016), por lo cual la búsqueda de Aeromonas debe ser parte del diagnóstico de rutina en coprocultivos (Mendes-Marques et al., 2012).
En conclusión, estos hallazgos indican que las cepas de Aeromonas aisladas en Oreochromis spp. tienen el potencial de causar enfermedades en humanos, y por lo tanto este alimento podría ser vehículo de Aeromonas spp. Los resultados de este trabajo enfatizan la importancia de monitorear Aeromonas spp. en alimentos y con elevado potencial patogénico con la finalidad de contribuir en la aportación de información sobre este microrganismo emergente y para tratar y controlar eficazmente cualquier evento epidemiológico causado por Aeromonas spp. en el futuro.
Declaración de ética: los autores declaran que todos están de acuerdo con esta publicación y que han hecho aportes que justifican su autoría; que no hay conflicto de interés de cualquier tipo; y que han cumplido con todos los requisitos y procedimientos éticos y legales pertinentes. El documento firmado se encuentra en los archivos de la revista.