Materiales y métodos

Área de estudio: El área en donde se localizan los sitios cafetaleros elegidos para este estudio está en la región del Soconusco al sur del estado de Chiapas, México, que se ubica entre los (15° 19’00’’ N & 92° 44’12’’ W), cubriendo 5 475 km² del territorio de Chiapas. El tipo de vegetación predominante hoy en día son los fragmentos de la selva perennifolia y del bosque mesófilo de montaña, rodeados por zonas agrícolas, cultivos de café y bosque secundario. Los principales tipos de suelo son Nitosoles y Cambisoles (^{INIFAP, 2010}). El clima es cálido húmedo y/o subhúmedo con abundantes lluvias en verano. La temperatura media anual varía de 21 a 26 °C y la precipitación total anual está en el intervalo de los 2 290 a 4 614 mm (^{CONANP, 2011}).

Sitios de recolecta: En noviembre del 2015, se recolectaron muestras de suelo rizosférico asociado a plantas de cafeto (Coffea canephora), en siete diferentes sitios de zonas cafetaleras localizadas en la región del Soconusco (Cuadro 1, Figura 1) y que abarcaron altitudes entre 400 y 1 300 m. En cada sitio se recolectaron tres muestras simples de suelo de aproximadamente 300 g cada una, obtenidas al pie de tres diferentes cafetos a una profundidad de 20 cm y a una distancia aproximada de 100 m entre sí. Con el objetivo de encontrar abundante esporulación, se llevó a cabo el muestreo durante la época de más escasa precipitación, que corresponde a los meses de octubre-diciembre (^{Cuenca & Lovera, 2010}). El manejo de los cafetales de donde se recolectaron las muestras es de bajo recurso tecnológico, con régimen de sombra parcial [realizada a través de podas a los árboles de sombra empleados (Ingaspp.)], sin plan ni sistema de fertilización, sin deshierbes manuales, sin aplicaciones de agroquímicos, y en donde se obtiene un promedio de producción de grano por hectárea de una tonelada por año (^{Moguel & Toledo, 1999}). Las plantaciones se seleccionaron en tales condiciones con la idea que el suelo fuese lo más conservado posible y así garantizar la presencia en condiciones de campo de HMA nativos.

Figura 1: Fincas cafetaleras en la región del Soconusco, Chiapas, México, en donde fue recolectado suelo rizosférico deCoffea canephorapara la obtención de esporas de hongos micorrizógenos arbusculares para este estudio.  

Extracción de las esporas de HMA: Las esporas de HMA se extrajeron con la técnica de tamizado húmedo y decantación (^{Gerdemann & Nicolson, 1963}) modificada por ^{Brundrett, Bougher, Dell, Grove y Malajczuk(1996}). Así, para cada una de las muestras de suelo recolectadas se pesaron 100 g de suelo seco, se adicionaron 400 mL de agua y se realizó una suspensión mediante agitación mecánica para romper los agregados del suelo; posteriormente la suspensión se pasó en tamices con malla de 1 000 y 44 micras a un mismo tiempo. La muestra de suelo retenida en los tamices se colocó en dos tubos (50 mL), los cuales fueron centrifugados a 2 500 rpm por 5 min. El sobrenadante fue eliminado y la muestra de suelo retenida se re-suspendió en otros dos tubos que contenían una solución de sacarosa al 60 % y se centrifugaron nuevamente a 1 200 rpm por 5 min recuperando el sobrenadante en el tamiz de 44 μm. Se usó una caja de Petri dividida en cuadrantes (0.5 × 0.5 cm) para extraer las esporas de HMA, considerando solo aquellas que presentaron contenido y coloración homogénea. Las esporas se colocaron en preparaciones permanentes, usando alcohol polivinílico en lactoglicerol (PVLG) y PVLG + reactivo de Melzer (1:1), según lo recomendado por la International Culture Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi(^{INVAM, 2016}). Las esporas se observaron en un microscopio óptico (Iroscope mod. ES-24®) para determinar su abundancia por conteo directo.

Determinación taxonómica de los HMA: Las preparaciones permanentes de las esporas de HMA se observaron en un microscopio óptico equipado con luz polarizada e iluminación Nomarski (Zeiss Mod 62223®) para examinar y contrastar las capas que componen la pared de las esporas y así determinar su consistencia, arreglo, reacción al reactivo de Melzer, presencia de ornamentaciones, escudos de germinación y tipo de hifa. Estas características morfológicas fueron la base para la determinación taxonómica de los HMA, considerando las descripciones especializadas de las especies reportadas a nivel mundial y disponibles en el sitio web http://www.amf-phylogeny.com/; así como las descritas en el manual de ^{Schenck y Pérez (1990}) y en la International Culture Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi(http://invam.wvu.edu/; INVAM, 2016). Para la nomenclatura taxonómica de los HMA se siguió la propuesta de ^{Schüßler y Walker (2010}), y se verificó en el Index Fungorum. Las preparaciones de referencia fueron depositadas en el Laboratorio de Biosistemática de Leguminosas, Departamento de Biología, Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.

Análisis físico y químico del suelo: Los suelos de los siete sitios de las zonas cafetaleras en estudio fueron analizados, con la finalidad de tener información de las condiciones de fertilidad edáfica que permitieran interpretar y relacionar los resultados relativos a la abundancia, riqueza y composición de especies de HMA asociados con las plantas del café en cada sitio cafetalero. Los análisis se llevaron a cabo en el Laboratorio Institucional Acreditado, de Análisis de Suelos y Plantas de Ecosur, San Cristóbal, siguiendo la Nom-012-RECNAT-2000 (^{SEMARNAT, 2002}). El pH activo del suelo se determinó con un potenciómetro equipado con un electrodo (Corning^®), en una suspensión de suelo: agua destilada en proporción 1:2 (peso/volumen). La conductividad eléctrica (CE) se determinó por extracto de saturación y filtración al vacío de una pasta de suelo saturada con agua destilada y se midió con un conductivímetro (Corning^®). La materia orgánica del suelo (MO) se cuantificó por el procedimiento de ^{Walkley y Black (1934}). El fósforo disponible (PO₄ ^-3) se extrajo con NaHCO₃(pH = 8.5) y se determinó de acuerdo con ^{Olsen, Cole, Watanabe y Dean (1954}). La textura del suelo se determinó con el hidrómetro de ^{Bouyoucos (Bouyoucos, 1962}) y, por último, la capacidad de intercambio catiónico se calculó por el método del acetato de amonio (^{Rhoades, 1982}). Todos los datos fueron expresados en peso seco de suelo.

Una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis (H) y una de medias por rangos se utilizaron para detectar diferencias en la abundancia de esporas, riqueza de morfoespecies y propiedades del suelo determinadas en los sitios de estudio. Un índice de disimilitud por distancias euclidianas con el método de Ward, basado en presencias-ausencias, fue usado para comparar la composición de especies de HMA entre los sitios; el índice es diferente de cero cuando hay completa disimilitud. La relación entre la estructura de las comunidades de HMA y las propiedades del suelo por sitio de cafetos fue explorada con un análisis de componentes principales (ACP). Los análisis se realizaron con el programa STATISTICA ver 6.0 y en todos los casos se usó una P ≤ 0.05.

Resultados

Los sitios San Luis Nexapa, Platanar y Providencia registraron la mayor abundancia de esporas de HMA en 100 g de suelo seco (H = 2.6, P ≤ 0.041), con valores promedio de 174 258 y 273, respectivamente; mientras que en los otros sitios presentaron menor abundancia con valores cercanos a las 100 esporas: 94 en San Agustín, 136 en 20 de noviembre, 96 en Victoria y 76 en Toluca.

El análisis taxonómico convencional de las esporas reveló la presencia de 20 morfoespecies de HMA pertenecientes a cuatro géneros: Acaulospora, Glomus, Gigaspora y Sclerocystis, además se detectó el género Scutellospora por la presencia de células auxiliares en el suelo. Los géneros más frecuentes fueron Acaulospora y Glomus, con diez y siete morfoespecies, respectivamente. Asimismo, algunos HMA comoS. taiwanensiyA. laevis, registrados en cafetos de Toluca y Victoria fueron exclusivos de estos sitios (Cuadro 2). Para el estado de Chiapas se reportan por primera vez cinco nuevos registros de HMA, dos del género Acaulospora, dos de Glomus y uno de Sclerocystis(Cuadro 2, Figura 2). Los sitios cafetaleros Toluca y Victoria registraron la mayor riqueza de HMA con 17 morfoespecies cada uno; en contraste los de San Agustín y 20 de noviembre tuvieron la menor riqueza con cuatro morfoespecies cada uno (H = 2.1, P ≤ 0.036). Mientras que San Luis Nexapa, Platanar y Providencia presentaron valores intermedios de riqueza, con entre siete y ocho morfoespecies de HMA por sitio (Cuadro 2).

Figura 2 Esporas de los nuevos registros de hongos micorrizógenos arbusculares. A. Acaulospora foveata, Janos & Trappe; B. Acaulospora rehmii Sieverd. & S. Toro; C. Sclerocystis taiwanensisC.G. Wu & Z.C. Chen; D.Glomus tortuosum N.C. Schenck & G.S. Sm.; E. Células auxiliares del género Scutellospora; F.Glomus trufemiiB.T. Goto, G.A. Silva & Oehl.  

Los suelos de todos los sitios estudiados tienen un pH ácido que difirió entre sitios (H = 7.4, P ≤ 0.049), con valores en el intervalo de 4.5 a 5.9, con el valor más bajo registrado en el Platanar y el más alto en el suelo de 20 de noviembre. La CE del suelo fue baja sin diferencias entre los sitios. La capacidad de intercambio catiónico tampoco difirió entre los siete sitios (H = 9.6, P ≤ 0.12). Todos estos suelos son considerados de textura franca, la mayoría con un componente arenoso importante, con excepción de Victoria que tuvo mayor cantidad de arcilla. El P disponible varió entre los sitios (H = 3.3, P ≤ 0.001). En Toluca y Victoria se detectó menor concentración de PO₄ ^-3, en contraste con San Agustín, 20 de noviembre y San Luis Nexapa que presentaron mayor concentración de este nutrienteen el suelo. En el caso de Providencia y Platanar, el PO₄ ^-3fue también menor, pero los valores registrados no fueron tan reducidos como en Toluca y Victoria. Los suelos de Toluca, 20 de noviembre, Platanar y Providencia registraron mayor concentración de MO que los de San Agustín, Victoria y San Luis Nexapa (Cuadro 3).

La composición HMA mostró que los suelos de Victoria y Toluca tuvieron una disimilitud del 97 % con respecto a la composición de HMA en el suelo de los otros cinco sitios (Figura 3). Por su parte, la composición de HMA en el suelo de los sitios Platanar y Providencia difirió en un 26 % de aquella en San Luis Nexapa, 20 de noviembre y San Agustín, los cuales tuvieron entre ellos mayor similitud en la composición de HMA. El ACP, cuyos ejes principales explicaron el 62.5 % de la varianza total (Figura 4), ordenó a los sitios, a la abundancia de esporas y a la riqueza de HMA, con base en el P disponible y la CIC; en donde la riqueza de HMA correlacionó negativamente con el PO₄ ^-3(-0.699) y positivamente con la CIC (0.687). Asimismo, con respecto a la composición de HMA, el ACP indicó que algunos HMA como G. margaritaoGlomussp.3 prefieren sitios con suelos arenosos (Toluca y Platanar) en comparación con Gl. Ambisporum y Gl. Fuegianum que al parecer prefieren suelos con mayor porcentaje de arcillas (e.g. Victoria).

Figura 3 Disimilitud en la composición de hongos micorrizógenos arbusculares en el suelo rizosférico de Coffea canephora entre siete sitios en fincas cafetaleras de la región del Soconusco, Chiapas, México.  

Figura 4 Análisis de componentes principales que relaciona las propiedades del suelo (en vectores) con los hongos micorrizógenos arbusculares (Abundancia de esporas=AbEsp, composición de especies y riqueza de especies= Riq. especies HMA) en el suelo rizosférico de Coffea canephora en siete sitios cafetaleros de la región del Soconusco, Chiapas, México.  

Discusión

Acaulospora foveata, Janos y Trappe está presente en varios ecosistemas de México (^{Montaño et al.,2012}); sin embrago, no se tenía registro para el estado de Chiapas. A. foveatafue descrita por primera vez en 1982 en cultivos de caña de azúcar en el estado de Veracruz, así como en platanares y cacaotales de Costa Rica y Panamá (^{Janos & Trappe, 1982}; ^{Trejo et al., 2015}).Acaulospora rehmii Sieverd. y S. Toro se ha reportado en bosque tropical seco y húmedo sin perturbar; así como en agro-ecosistemas de México, entre ellos fincas cafetaleras en Veracruz (Trejo et al.,2011); no obstante, en Chiapas no se conocía, por lo que también es un nuevo registro para este estado. Sclerocystis taiwanensis C.G. Wu y Z.C. Chen es un HMA raro en México, se ha registrado en sistemas agroforestales de aguacate en Michoacán (^{Bárcenas, Varela, Stürmer, & Chávez-Barcenas, 2011}) y plantaciones de café en Veracruz México (^{Posada et al., 2016}), por lo que su detección en la región del Soconuscoindica que es un componente importante de la riqueza de HMA en otros sistemas agroforestales cafetaleros en regiones tropicales húmedas. Así, este es el primer registro de S. Taiwanensis para el estado de Chiapas; un HMA que forma esporas arregladas de forma radial en esporacarpos, similar a S. clavispora; sin embargo, difiere de esta especie en que los esporocarpos y las esporas son de menor tamaño y en el ápice de las esporas presentan una división central en forma de una depresión (^{Chi-Guang & Zuei-Ching, 1987}). Asimismo, Glomus tortuosum N.C. Schenck y G.S. Sm. se registra por primera vez para el estado de Chiapas, ya que en México se había documentado de otros ecosistemas tropicales secos y sistemas agroforestales con frutales (Montaño et al., 2012), y en particular no se había registrado en sistemas de cultivo de café (^{Arias et al., 2012}; Trejo et al., 2011) y tampoco se conocía de otros ecosistemas de Chiapas (^{Violi et al., 2008}; ^{Pérez-Luna, Álvarez-Solís, Mendoza-Vega, Pat, Gómez-Álvarez, & Hernández-Cuevas, 2012}). En México, Glomus trufemii B. T. Goto, G. A. Silva y Oehl, se ha registrado recientemente en ecosistemas semiáridos en el estado de Oaxaca (Comunic. Pers., Hernández-Cuevas Laura). Esta especie se caracteriza por formar esporas subglobosas a elípticas (< 100 micras) dispuestas en esporocarpos laxos sin peridio, las esporas presentan una pared compuesta de dos capas, la más externa es hialina, semipermanente y está ausente en esporas maduras; la segunda capa es permanente, laminada, de color naranja rojizo y ninguna de las capas reacciona al reactivo de Melzer; además, la hifa se caracteriza por un cambio de coloración marcado en la base de las esporas. G. trufemii fue registrada por primera vez en dunas de Brasil (^{Tomio-Goto, Gomes, Alves Da Silva, Furrazola, Torres-Arias, & Oehl, 2012}). De esta manera, esta especie de HMA corresponde también al primer reporte para el estado de Chiapas y de manera oficial para México.

Existen patrones de interacción complejos entre las comunidades de HMA y de plantas, la riqueza y composición de HMA pueden diferir en función de los hospederos disponibles, la esporulación entre las especies de HMA y las condiciones edáficas (^{Smith & Read, 2008}). El manejo agronómico afecta negativamente a las comunidades de HMA con respecto a los sitios agrícolas que tienen una orientación orgánica (^{Oehl, Sieverding, Ineichien, Mader, Wiemken, & Boller, 2009}; de Beehouwer et al., 2015). En contraste, los sitios con manejo orgánico y vegetación nativa combinada con el cultivo del café incrementan la presencia de hospederos potenciales y generan condiciones edáficas particulares que benefician la relación de los hospederos con los HMA. Lo anterior, apoya la idea de que la riqueza de HMA se debe a la mayor diversidad de especies vegetales que caracterizan a los sistemas cafetaleros con baja y media tecnificación como ocurre en los sitios estudiados, misma que puede proveer más nichos ecológicos para las especies de HMA como se ha reportado en otras investigaciones (^{Chifflot, Rivest, Oliver, Cogliatro, & Khasa, 2009}; ^{Trejo et al., 2011}).

Es posible que la abundancia de esporas de HMA sea mayor en sistemas donde se utilizan especies arbóreas de manera intercalada en comparación con aquellos con monocultivo, o bien que se trate de sitios con vegetación en un estado de perturbación o madurez intermedios y con hospederos dominantes que pudieran estar promoviendo la producción de esporas como se ha reportado en plantaciones de banano (^{Mahecha-Vásquez, Sierra, & Posada 2017}). Esto ayudaría a explicar los valores intermedios de riqueza de morfoespecies de HMA en los cafetos de sitios como San Luis Nexapa, Platanar y Providencia, los cuales a su vez presentan mayor abundancia de esporas y una composición de morfoespecies intermedia. Esta idea podría estar apoyada en la hipótesis de que a niveles intermedios de perturbación la riqueza específica se ve favorecida, posiblemente porque en los ecosistemas menos perturbados, dominan especies mejor adaptadas y más competitivas (^{Roxburgh, Shea, & Wilson, 2004}), las cuales podrían favorecer a los HMA como se ha reportado en otras plantaciones tropicales (Mahecha-Vásquez et al., 2017). No obstante, es necesario explorar más sitios estratégicos y desarrollar metodologías más sensibles para la detección de todas las especies de HMA, ya que no se descarta la posibilidad de que las morfoespecies identificadas de HMA puedan estar subestimadas, debido a la dificultad de caracterizar aquellos HMA no esporulantes o en estado de latencia.

La alta riqueza y la distinta composición de especies de HMA asociadas a los cafetos de Victoria y Toluca en relación con otros sitios como San Agustín, 20 de noviembre y San Luis Nexapa, podrían atribuirse a que los suelos de Victoria y Toluca registraron menos P disponible. Varios estudios muestran que las plantas en general (^{Smith, Jakobsen, Gronlun, & Smith, 2011}), incluyendo las de café (^{Vaast et al., 1997}; ^{Andrade et al., 2009}; ^{Trejo et al., 2011}), requieren de establecer una simbiosis funcional con los HMA cuando la disponibilidad del P es reducida, ya que la micorriza arbuscular facilita el acceso de las raíces de la planta hospedera a nutrientes con poca movilidad en el suelo (Smith & Read, 2008; ^{Cuenca, 2015}), aspecto que es frecuente en suelos moderadamente ácidos (4.5 - 6). Un pH ácido promueve la fijación química del PO₄ ^-3con el aluminio (Al⁺³), lo que reduce la disponibilidad de este nutriente en el suelo (^{Bünemann, Oberson, & Frossard, 2011}) y se ha visto que en estas condiciones es frecuente la presencia de HMA de los géneros de Acaulospora y Ambispora (^{Castillo, Borie, Godoy, Rubio, & Sieverding, 2006}; Cuenca, 2015; Trejo et al., 2015; ^{Posada et al.,2016}), lo que explicaría la dominancia de Acaulospora en los cafetos examinados en este estudio y resalta la importancia de éste género en las comunidades de HMA en condiciones de baja disponibilidad de P en el suelo. Asimismo, debido a que estos géneros de HMA se reportan también en suelos con alto P disponible, pero con pH ácido, es posible que en los sitios de cafeto examinados en este trabajo, el pH promueva de forma importante la presencia de estos géneros y de la riqueza de HMA como ocurre en otras plantaciones (^{Mahecha-Vásquez et al., 2017}).

En el sentido anterior, es necesario destacar que la alta abundancia de esporas y los valores intermedios de riqueza de especies de HMA en los cafetos de Providencia y Platanar podrían también estar asociados a una baja disponibilidad de Pen el suelo; sin embargo, las concentraciones de PO₄ ^-3detectadas podrían sugerir un intervalo de disponibilidad menos drástico en estos sitios, lo que permite la presencia de algunos HMA también registrados tanto de los sitios con mayor como con menor P disponible en el suelo. ^{Vaast et al. (1997}) indican que algunas especies de HMA tienen una mejor respuesta a determinados niveles de P disponible que otras, como resultado de su diferente capacidad para capturar este nutriente del suelo. Por su parte, la relación positiva detectada entre los HMA y la CIC sugiere, por un lado, que la adquisición de formas catiónicas de otros nutrientes podría no depender de la asociación entre los HMA y los cafetos en la región del Soconusco, en donde las arcillas y la MO estarían probablemente aportando estos nutrientes; y por el otro, que un fuerte remplazo del Al⁺³podría estar ocurriendo en la superficies de intercambio catiónico del suelo, promoviendo su solubilización y combinación con el PO₄ ^-3para formar compuestos insolubles que reducen la disponibilidad del P (^{Bünemann et al., 2011}). No obstante, si bien la asociación negativa entre el P del suelo y el desarrollo de la micorriza arbuscular es un aspecto que ha sido ampliamente documentado, no hay reportes del efecto de los nutrientes catiónicos del suelo sobre los HMA.

En conjunto, los resultados de este estudio muestran que la disponibilidad del P, ligada a la acidez del suelo, podría estar regulando las comunidades de HMA en el suelo de la rizosfera de los cafetos en la región del Soconusco, Chiapas, lo que coincide con otras investigaciones que indican la relevancia de las características del suelo sobre los HMA en otras plantaciones de café (de Beehouwer et al., 2015, ^{Posada et al., 2016}). Así, se sugiere que podrían haber consorcios de HMA específicos para los niveles de P y acidez presentes en diferentes sitios con cafetos, o bien consorcios de especies de Acaulospora y Glomus que pudieran ser comunes para las condiciones ambientales en las que se desarrolla el café, cuya identificación y compatibilidad funcional debe ser examinada antes de emplearse como biofertilizantes dirigidos a favorecer el desarrollo y rendimiento de los cafetos, como lo reportan otros estudios (^{Aguirre-Medina, 2006}; ^{Trejo et al., 2011}; ^{Adriano et al., 2011}).

En conclusión, los diferentes sitios con cultivo de café examinados en este estudio contienen cinco nuevos registros para el estado de Chiapas y una importante riqueza de HMA, cuya dinámica podría depender de la disponibilidad de P y acidez en el suelo. Los HMA del género Acaulospora parecen ser los más frecuentemente registrados bajo las condiciones edáficas de la época de secas en las que crece Coffea canephora en la región del Soconusco, Chiapas; no obstante, es necesario examinar el efecto que pudieran tener las diferentes especies HMA registradas para la familia Glomeraceae; ya que en conjunto pudieran tener influencia positiva sobre el desarrollo y rendimiento de esta variedad de café; esta información permitiría seleccionar aislados y/o consorcios de HMA para la obtención de biofertilizantes nativos aplicables al cultivo de Coffea canephora en esta región de México.