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Revista de Biología Tropical

On-line version ISSN 0034-7744Print version ISSN 0034-7744

Rev. biol. trop vol.61 n.2 San José Jun. 2013

 

Detección serológica y caracterización molecular de Potato virus S (PVS, Carlavirus) en cultivos de papa de Colombia

Detection and molecular characterization of
Potato virus S (PVS, Carlavirus) from Colombia

José Fernando Gil1*, José Miguel Cotes2* & Mauricio Marín1

*Dirección para correspondencia:


Abstract

In Colombia, potato crops are affected by a wide variety of viruses such as PVY, PLRV, PVX, PMTV and PVS. Unfortunately, there are very few studies on the biology, distribution and pathogenicity of these viruses; this situation is even worse for the latent virus PVS. In this work, we evaluated the presence of PVS in four Colombian provinces (Antioquia, Boyacá, Cundinamarca, Nariño) by the use of  ELISA. We also studied the degree of molecular variation by sequence comparison of a segment of the gene encoding for the viral coat protein. In average, PVS was detected in 40% of 320 analyzed samples of potato leaves; the highest levels were observed in the East of Antioquia (49%) and Pasto (Nariño) (47%), while in the other regions ranged between 35% and 42%. Analysis of sequence revealed the presence of two PVS strains in Colombia: three isolates were associated to PVSO (Ordinary) and twelve belonged to PVSA (Andean). A high diversity was observed among PVSA strains with percent identities in the range of 88-99%. These findings highlight the importance of strengthening seed certification programs and quarantine measures in Colombia for viruses like PVS, which can cause losses of up to 20% in potato crops and even higher in mixed virus infection.

Key words: Betaflexiviridae, DAS-ELISA, RT-PCR, Solanum tuberosum, viral capsid.

Resumen

El cultivo de papa en Colombia es afectado por diversos virus, que incluyen PVY, PLRV, PVX, PMTV y PVS; aunque se han realizado pocos estudios sobre la biología, distribución  y  patogenicidad de dichos virus en Colombia, siendo especialmente escasa la información referente al PVS. En este  trabajo  se evaluó mediante pruebas de ELISA, la presencia del PVS en cuatro departamentos de Colombia, así como sus niveles de variación, a partir de la secuenciación de una porción del gen de la cápside viral. Los resultados indicaron una detección promedio del virus en el 40% de las 320 muestras analizadas, con zonas como el  Oriente cercano de Antioquia (49%) y Pasto  (Nariño) (47%), donde se detectó en mayor proporción el virus. Los análisis de variación  molecular indicaron la presencia de las dos razas de PVS (Ordinaria y Andina) en Colombia, siendo los aislamientos de PVSA los más diversos, al presentar un rango de identidad del 88 al 99%. Estos hallazgos indican que es imperativo el fortalecimiento de los programas de certificación de semilla y vigilancia cuarentenaria en  el país, especialmente para virus como el  PVS, que aunque puede ser asintomático,  causa pérdidas hasta del
20% en cultivos de papa.

Palabras clave:  Betaflexiviridae,  capside   viral,  DAS- ELISA, RT-PCR, Solanum tuberosum.



El Potato virus S (PVS) es un miembro del género Carlavirus, familia Betaflexiviridae, que incluye seis géneros y 66 especies de virus (Adams & Kreuze 2008, ICTV 2012). Este virus presenta forma filamentosa de 610- 710nm y un genoma de ARN de cadena sencilla con orientación positiva (ARNss+) de cerca de 8 500 nucleótidos (nt). El extremo 5´del ARN está protegido con una caperuza y el 3´tiene una cola de poli-Adenina. El genoma codifica para seis genes; el primero codifica para un polipéptido de 223kDa que contiene motivos conservados para una helicasa, metiltransferasa y ARN polimerasa ARN dependiente (RdRp). Los genes 2, 3 y 4 comprenden el triple bloque de genes (TGB), que participan en el movimiento intra e intercelular del virus, mientras que el gen 5 de ~970nt, codifica para la cápside viral (CP) de 34kDa. Este gen se traslapa con el gen 6 que codifica para una proteína rica en cisteína de unión a ácidos nucleicos (NABP), involucrada en la transmisión por áfidos, silenciamiento de genes del hospedante y en la replicación viral (Matoušek et al. 2005, Lin et al. 2009, Salari et al. 2011).

El  PVS  es  considerado  como  uno  de los virus que dependen de la papa (Solanum tuberosum) para su supervivencia y diseminación, por lo que es de esperar que su mayor variabilidad se encuentre en la región andina, centro  de  origen  de  su  hospedante  (Salazar 1995). En muchas variedades de papa cultivadas en el mundo, el VS es asintomático o causa síntomas suaves, por lo que se denomina como un virus latente (Salari et al. 2011). Sin embargo, sus niveles de incidencia pueden alcanzar hasta el 100% en un cultivo o región, gracias  a  su  eficiente  transmisión  mecánica, por tubérculos-semilla y por áfidos (Wardrop et al. 1989). A pesar de la condición latente de este virus, se ha estimado que puede ocasionar pérdidas en los cultivos de papa, que oscilan entre un 10 y 20% (Rose 1983, Dolby & Jones 1987, Jeffries 1998). Adicionalmente, el PVS presenta una reacción sinérgica con otros virus como el Potato virus X (PVX), que conduce a que ocasione síntomas más severos, aumente su tasa replicativa y por ende, cause un mayor efecto detrimental sobre el número total de tubérculos producidos por las plantas (Nyalugwe et al. 2012).

Tradicionalmente, se han descrito dos razas de este virus: PVSO y PVSA (Ordinaria y Andina,  respectivamente),  con  base  en  su reacción diferenciada (local o sistémica) sobre plantas indicadoras de  Chenopodium quinoa; sin embargo, la denominación de las razas no implica su ocurrencia en una región específica, por cuanto ambas variantes han sido detectadas en  Europa, América, Asia  y  Oceanía  (Mackenzie et al. 1989, Matoušek et al. 2000, Cox & Jones 2010). Las identidades en porcentaje de nt entre ambas razas, en las secuencias que codifican para la proteína de cápside (CP) y la proteína de 11kDa son de 81% (93% para aminoácidos (aa)) y 83% (77% para aa), respectivamente (Lin et al. 2009). En estas proteínas también se encuentra el mayor número de aa que difiere entre ambas razas, particularmente hacia el extremo N-terminal de CP (Foster & Mills 1992, Matoušek et al. 2000).

PVSA induce  síntomas  más  severos  en las plantas infectadas, incluyendo senescencia prematura y pérdida de hojas (Jeffries 1998), además  es  más  eficientemente  transmitido por áfidos que aislamientos de PVSO, siendo las especies Myzus persicae, Rhopalosiphum padi, Aphis fabae y A. nasturtii sus vectores principales (Wardrop et al. 1989, Lambert et al. 2012). Estudios recientes han encontrado variantes de PVSO con capacidad de generar una  invasión  sistémica  en  C.  quinoa,  pero que son filogenéticamente distantes a PVSA (Matoušek et al. 2005, Lambert et al. 2012) y que por tanto, han recibido la denominación de VSO-CS (CS: Chenopodium systemic). Sin embargo, se desconoce la existencia de aislamientos de PVSA que no causen infección sistémica en C. quinoa (Cox & Jones 2010).

En Colombia, los estudios de genotipificación e incidencia de virus en cultivos de papa son muy escasos. Sin embargo, los pocos realizados indican altos niveles de infección de Potato virus Y (PVY) (Gil et al. 2011a) y Potato leafroll virus (PLRV) (Gil et al. 2011b) en cultivos de las principales regiones productoras de papa en este país, así como en la Colección Central Colombiana (CCC) de papa, una colección de germoplasma que consta de cerca de 2 900 accesiones de S. tuberosum subespecies andigena y tuberosum, S. phureja, S. chaucha y especies silvestres como S. colombianum y S. estradae (Corpoica 2005). En este sentido, en un estudio que evaluó mediante pruebas de inmunoimpresión  el  estado  de  sanidad  viral de algunas accesiones de la CCC, se encontró que el virus más prevalente entre las 34 accesiones bajo estudio fue PVS, con un 61.3% de detección (Franco-Lara et al. 2009); mientras que Gúzman et al. (2010) encontraron a partir de pruebas de DAS-ELISA, que el 85% de las 585 accesiones evaluadas presentaban reacción positiva con anticuerpos específicos para PVS. Estos autores también encontraron que PVS no se encontraba como el único virus afectando las accesiones, sino que en la mayoría de casos, hacía parte de complejos virales con Potato virus X (PVX), PVY y PLRV, por lo que no se descartan efectos sinergísticos en la expresión de síntomas y en la reducción de la producción. Dichos resultados conducen a cuestionar la importancia que juega el PVS en la producción de papa de este país suramericano, ya que debido a su condición de virus latente, es muy poco lo que se conoce sobre su biología, distribución y efecto en los cultivos de papa de Colombia. Con el fin de acortar la brecha de información sobre este virus, se realizó el presente estudio, para determinar los niveles de detección de PVS en muestras de cultivos de papa de cuatro departamentos de Colombia, y realizar una evaluación de la variabilidad genética de 15 aislamientos del virus, a partir de la secuenciación parcial del gen CP.

Materiales y métodos

Detección  del  PVS:  Para  esta  evaluación se realizó, muestreos aleatorios en ocho cultivos de S. tuberosum ssp. andigena de las variedades Capiro, Parda Pastusa, Esmeralda, Suprema, Unica, Nevada, y de S. phureja variedad Criolla Colombia, ubicados en tres zonas productoras  del  departamento  de  Antioquia y Cundinamarca y en dos zonas de Boyacá y Nariño, respectivamente; durante 2009-2010 (Cuadro 1). En cada cultivo se realizó una colección aleatoria de cuatro muestras conformadas por dos folíolos jóvenes del extremo apical de las hojas, para generar una muestra compuesta. Las muestras se secaron a temperatura ambiente, se empacaron en bolsas plásticas selladas y se enviaron por servicio de courier al laboratorio para su conservación a -80°C.

En  todos  los  casos,  el  período  transcurrido entre la colecta y almacenamiento de las muestras no superó las 24hr. Las 320 muestras (4 muestras x 8 cultivos x 10 zonas) se evaluaron para la detección de PVS mediante pruebas de DAS-ELISA con anticuerpos policlonales de la compañía Agdia (Indiana, USA), siguiendo las  instrucciones  del  fabricante.  Los  resultados  colorimétricos  fueron  cuantificados  en un equipo Multiscan (Labsystem, Finlandia), incluyendo en cada prueba un control positivo y un control negativo (suministrados en forma liofilizada por el fabricante). Los pozos fueron considerados con reacción positiva cuando la lectura de absorbancia a 405nm presentó un valor mínimo del doble de la lectura obtenida en el control negativo, siguiendo el criterio de Matthews (1993).

Los resultados fueron analizados a través de un modelo lineal generalizado aleatorio considerando  una  distribución  binomial  para la variable presencia de virus y utilizando una función  de  ligamiento  logit.  Para  el  análisis de los datos se consideraron d departamentos (i=1,2,…,d); mi zonas dentro de departamentos (j=1,2,…,b;  donde  b=Σmi),  Fij lotes  dentro de zonas y departamentos (k=1,2,…,c;  donde c=ΣΣFij), y n observaciones totales. Así para el vector y de observaciones de presencia/ausencia de PVS, en la planta l del lote k dentro de la zona j del departamento d,  se consideró el siguiente modelo lineal generalizado (Littell et al. 2006, McCulloch et al. 2008):



donde, en su orden, 1 y μ son el vector de unos de tamaño n y la media general; Z1 y u1 son la matriz de presencia n×a y el vector a×1 de efectos aleatorios de departamento, Z2 y u2 son la matriz de presencia n×b y el vector b×1 de efectos aleatorios de zonas dentro de departamentos, Z3 y u3 son la matriz de presencia n×c y el vector c×1 de efectos aleatorios de lotes dentro de zonas y departamentos; y e es el vector de efectos residuales. En este estudio se supone que el vector y sigue una distribución de Bernoulli, y que los efectos de departamentos, zonas dentro de departamentos, y lotes dentro de zonas y departamentos siguen una distribución normal con media cero y varianza σ2u1, σ2u2 y σ2u3. Para la predicción de la presencia () se utilizó el mejor predictor lineal insesgado (BLUP, por sus siglas en inglés) para el efecto respectivo, usando la siguiente expresión:


Para el análisis estadístico se utilizó el procedimiento GLIMMIX del programa estadístico SAS versión 9.2.

Variabilidad  genética  de  aislamientos de PVS: El ARN molde necesario para amplificar un fragmento del gen de la proteína de la cápside de PVS por medio de la técnica de RT-PCR se obtuvo a partir de extracciones de ARN total de una mezcla de folíolos de papa que fueron positivos a la prueba de ELISA, mediante el kit RNeasy plant mini (Qiagen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las reacciones de RT-PCR se realizaron en dos pasos con los cebadores PVSCPF (5’- CTA GRC AAT TGC GAG CTC AC-3’) (Ali et al. 2008) y PVSR (5’-ATG ATC GAG TCC AAG  GGC ACT  G-3’),  que  están  dirigidos a regiones conservadas del gen CP de PVS y por tanto amplifican una porción de este gen en variantes ordinarias y andinas de este virus (Nie & Singh 2001, Ali et al. 2008). Las reacciones de retrotranscripción se realizaron con la enzima M-MuLV transcriptasa reversa (20U/µL) (Fermentas, Lituania) a 37°C por 60min y el programa de PCR consistió en 95°C por 30s, seguido de 40 ciclos de 95°C por 30s, 53°C por 45s, 72°C por 1min y una extensión final a 72°C por 5min. Los amplicones del tamaño esperado (~629pb) fueron purificados directamente del gel mediante el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) y secuenciados en un secuenciador ABI Prism 3730xl (PE Applied Biosystems, USA).

Las secuencias obtenidas con cada cebador fueron editadas mediante el software BioEdit 6.0.6 (Hall 1999), construyéndose secuencias consenso y confirmándose su identidad con genes virales por comparación con las bases de datos moleculares mediante BLAST. El alineamiento incluyó las secuencias obtenidas en el estudio y aquellas depositadas en el GenBank representando las variantes principales de PVS. Para esto se alinearon las secuencias mediante el software Clustal W (Larkin et al. 2007) y se  realizó  un  análisis  filogenético  mediante el método de Máxima Parsimonia utilizando el software MEGA versión 5.0 (Tamura et al. 2011). El soporte de la topología interna de los dendrogramas fue determinado por análisis de bootstrap con 1 000 remuestreos (Felsenstein 1985). Adicionalmente, se realizó un análisis de distancia genética basado en el número de sustituciones por sitio, empleando la metodología de Máxima Probabilidad Compuesta (Tamura et al. 2004) mediante el software MEGA versión 5.0 (Tamura et al. 2011).

Resultados

Evaluación de la presencia de PVS: Los resultados de los análisis serológicos indicaron la presencia  promedio  del  40%  del  PVS  en los  cuatro  departamentos  evaluados,  siendo las muestras de los cultivos de papa de Cundinamarca  y  Antioquia  los  que  presentaron los mayores niveles de detección (58 y 45%, respectivamente), seguidos por Nariño y Boyacá, con 30 y 29%, respectivamente (Fig. 1). Dentro de los departamentos, las muestras de las regiones del Oriente Cercano de Antioquia y Pasto (Nariño) fueron en su orden las que tuvieron mayor presencia del virus, con 49 y 47%, respectivamente. Las demás zonas presentaron niveles de detección de PVS entre 35 y 42% (Fig. 1).

Variabilidad genética de aislamientos de PVS: Las pruebas de RT-PCR produjeron los amplicones del tamaño esperado (~629pb) con los cebadores PVSCPF y PVSR. El análisis de variabilidad genética se realizó utilizando 15 secuencias de fragmentos del gen de la proteína de cápside, de cepas de PVS procedentes de cultivos de papa de los cuatro departamentos bajo estudio de Colombia (Cuadro 2) y 28 secuencias de referencia obtenidas del GenBank, representando diferentes razas y orígenes geográficos del virus (Fig. 2). Así mismo, se utilizó como grupo externo una secuencia de CP de la especie tipo del género Carlavirus, Carnation latent virus (CLV) (Accesión X52627). El dendrograma resultante generó dos grandes clados  que  representan  las  razas  PVSO (25 aislamientos  de  referencia  y  tres  de  Colombia) y PVSA (tres aislamientos de referencia y 12 de Colombia), y se presentan fuertemente respaldados por valores de bootstrap del 97 y 96%, respectivamente (Fig. 2). El primer clado, presentó seis subclados (I a VI), algunos de los cuales estuvieron apoyados por altos valores de bootstrap (ej. IV, VI). Tres de los aislamientos colombianos de PVS se presentaron en el clado I de PVSO, en conjunto con un aislamiento de Reino Unido y uno de Australia, mientras que los demás clados incluyeron indistintamente aislamientos de PVS obtenidos en Europa, Australia y Asia. Sin embargo, los aislamientos representativos de EEUU sólo se presentaron en el clado III.

Por otra parte, el grupo representando la raza Andina de PVS, se subdividió en tres subclados (I, II y III) (Fig. 2), con los dos primeros emparentados  filogenéticamente,  aunque  con un mediano soporte de bootstrap (81%). El primer subclado (I) sólo incluyó aislamientos colombianos de PVS procedentes de cultivos de los departamentos de Antioquia y Nariño (cuatro aislamientos), mientras que el II agrupó las secuencias de referencia de cepas de PVSA procedentes de India, Perú y República Checa. El subclado III presentó la mayor proporción de aislamientos colombianos de PVS (8 de 15 secuenciados), procedentes de todas las zonas cultivadoras de papa bajo análisis.

El análisis de distancia genética para todas las secuencias del gen CP de PVS, mostró un promedio  de  sustituciones  por  sitio  de  0.21 para nt y de 0.45 para aa; mientras que para el clado representando PVSO, dichos valores fueron de 0.05 (nt) y 0.12 (aa), y para PVSA de 0.17 (nt) y 0.42 (aa).

Al evaluar los niveles de identidad genética de nt, se encontró que los aislamientos colombianos identificados como PVSO, compartieron entre el 76 al 80% de similitud con respecto a las secuencias de las cepas de Colombia clasificadas como PVSA. Estos valores fueron superiores a 91% (máximo de 99%) para todos los aislamientos PVSO (colombianos e internacionales), mientras que para las secuencias bajo estudio de los aislamientos de PVSA, se encontraron valores de identidad de 88 a 99%.

La identidad de los aislamientos de PVS con respecto al CLV, utilizado como grupo externo de análisis fue de 43 a 48%.

Discusión

El cultivo de la papa en Colombia, participa con el 7.1% de la superficie sembrada en cultivos transitorios (128 701ha), aporta cerca de 7.8% de la producción agrícola con un volumen  de  2 272 772ton/año  y  genera  alrededor de  69 000  empleos  directos  (MADR  2009). Uno de los principales aspectos que afectan la producción de este cultivo son los problemas virales, sin embargo, el nivel de conocimiento que se tiene de la biología y relaciones patogénicas de los virus que afectan la papa en Colombia es bajo, lo cual se ve reflejado en las deficiencias que se presentan en las prácticas destinadas a su manejo, como por ejemplo en la producción de tubérculo-semilla certificada. El PVS es uno de los virus más prevalentes y menos caracterizados en los cultivos de papa de la región Andina (Salazar 1995), por lo que fue seleccionado en esta investigación para evaluar su presencia en diferentes regiones cultivadoras de papa de Colombia, así como sus niveles de variación genética.

Los resultados encontrados a partir de 320 muestras de plantas obtenidas en 10 zonas de cultivo de los cuatro principales departamentos productores de papa de Colombia, indicaron altos niveles de detección del virus, con un promedio general del 40% y departamentos como el de Cundinamarca y Antioquia, cuyas muestras en conjunto presentaron niveles de detección de 58 y 45%, respectivamente. En Colombia, no se contaba con antecedentes de estudios referentes a los niveles de presencia de PVS en cultivos de papa en producción, pero sí se tenían indicios de la alta prevalencia de este virus en la CCC de papa. Así, a partir de pruebas de inmunoimpresión y DAS-ELISA, se había encontrado que PVS era el virus que presentaba mayores niveles de detección, con valores del 61.3% (Franco-Lara et al. 2009) y 85% (Guzmán et al. 2010), respectivamente. Dichos hallazgos,   así como los aquí encontrados, plantean la necesidad de revisar la aplicación del programa de certificación de tubérculo-semilla en el país, pues en éste sólo se tolera 1%, 2% y 5% de presencia de PVS en semilla básica, registrada y certificada, respectivamente (ICA 2003). En adición, los altos niveles de detección de PVS en el país, se pueden explicar por el hecho que este virus causa síntomas suaves o incluso ocurre en forma asintomática en diferentes variedades de papa, enmascarándose su presencia en cultivos utilizados para la generación de semilla, lo que sumado a su alta transmisibilidad por tubérculo (Franc & Banttari 1996), favorece su rápida dispersión dentro y entre las diferentes regiones productoras de papa. Además, se ha reportado que PVS puede establecer sinergismos con otros virus como PVX (Lambert et al. 2012, Nyalugwe et al. 2012), que incrementan las pérdidas en la producción de papa.

Por otra parte, trabajos recientes adelantados por nuestro grupo (Gil et al. 2011a, b), tendientes a evaluar la presencia de PVY y PLRV en las mismas regiones analizadas en este estudio, determinaron que dichos virus alcanzaron niveles de presencia promedio del 72% y 20%, respectivamente. Lo anterior sugiere que es imperativo el establecimiento de un esfuerzo nacional en los organismos de sanidad vegetal estatal, agremiaciones de productores y agroindustrias de alimentos, para implementar prácticas que conduzcan a disminuir los niveles de infección del PVS y de los otros virus, de manera que se puedan mejorar los rendimientos de los cultivos y se garantice la calidad del tubérculo-semilla empleado en el país. En este sentido, sería de gran interés evaluar los niveles de incidencia de PVS en las diferentes regiones productoras, a partir de un muestreo representativo de las áreas cultivadas en cada zona y de un análisis altitudinal, que permita evaluar el impacto de la transmisión de PVS por vectores, ya que bajo las condiciones propias de la zona andina, se desconoce su papel epidemiológico en la dispersión de este virus.

Con respecto al análisis de variabilidad genética realizado a partir de la secuenciación de una porción del gen CP de 15 aislamientos colombianos de PVS, y su comparación con cepas de referencia de otros países del mundo, fue posible la detección e identificación en el país de las dos razas hasta ahora caracterizadas para esta especie viral: PVSO y PVSA, siendo la última aparentemente la más registrada, al incluir 12 de los 15 aislamientos secuenciados. En este caso, cepas de la raza A se encontraron a partir de muestras de Antioquia, Nariño y Cundinamarca, mientras que PVSO fue detectado  en  Boyacá  y  Cundinamarca.  Sería importante en el futuro adelantar trabajos locales que permitan definir si en dichas regiones se  presentan  indistintamente  ambas  razas  o por el contrario existe alguna  especialización dependiente de las condiciones medioambientales y varietales  prevalentes en cada región. Para nuestro  conocimiento, este trabajo es el primero que reporta la raza ordinaria de PVS a partir de muestras de papa de los Andes suramericanos y en el que se presentan mayores niveles de variación entre cepas de PVS de un mismo país (del 76 al 99%). Esta situación no resultaba inesperada, pues como lo planteó en su trabajo pionero Jones (1981), dicha región, al corresponder al centro de origen de la papa, también debe presentar la mayor diversidad de virus que han co-evolucionado con sus ancestros silvestres.

Trabajos similares al aquí presentado, que evalúan los niveles de diversidad de PVS con base  en  secuencias  de  CP,  han  encontrado una base genética más estrecha para los aislamientos de PVS caracterizados en diferentes regiones. Así por ejemplo, Salari et al. (2011) al evaluar los niveles de diversidad de 12 aislamientos de PVS procedentes de Irán, encontraron que todos los aislamientos correspondían a la raza PVSO  y que su diversidad global oscilaba entre 92.5 y 99.1%; mientras que Lambert et al. (2012) evaluando la variabilidad genética de aislamientos de PVS obtenidos en cultivos de papa de Tasmania (Australia), encontraron que éstos compartían niveles de identidad superiores al 95%, independientemente de causar infecciones sistémicas (PVSO-CS) o locales (PVSO) sobre C. quinoa. Similarmente, Lin et al. (2009) evaluaron las secuencias completas de dos aislamientos de PVS de EEUU, y encontraron que éstos compartían una identidad global para todo el genoma de 98% y de 98.6% para el gen de CP.

Por  otra  parte,  la  secuenciación  parcial del gen CP en 12 aislamientos de PVSA de Colombia, amplía el conocimiento sobre rango de variación de esta raza de PVS en el mundo, por cuanto en la mayor parte de  estudios de diversidad hasta ahora realizados,  siempre se utilizaban un máximo de cinco  aislamientos, con tan sólo dos procedentes de la zona Andina de Perú (D00461 y BAA00355), mientras que los otros fueron obtenidos en India (FJ643622), Reino Unido (AA085502) y República Checa (CAI06112). Así mismo, de gran interés resultaron los altos niveles de diversidad encontrados entre  aislamientos de esta raza en Colombia, pues los rangos de identidad para CP variaron de 88 a 99% y presentaron un promedio de sustituciones por sitio de 0.17 y 0.42 para nt y aa, respectivamente; valores éstos muy superiores a los encontrados para los aislamientos de la raza ordinaria, más aún si se tiene en cuenta que éstos contemplan aislamientos de diferentes continentes (91 a 99% de identidad y 0.05 (nt) y 0.12 (aa) de sustituciones por sitio). De interés resultará en el futuro la inoculación de dichos aislamientos sobre plantas de C. quinoa, por cuanto desde el registro original de la raza PVSA por Hinostroza-Orijuela (1973) y su confirmación posterior a partir de un aislamiento encontrado en cultivos de papa de Wisonsin (EEUU) por Slack (1983), se ha considerado que a diferencia de PVSO, esta raza tiene la capacidad  de  inducir  infecciones  sistémicas en dicho hospedante experimental. Sin embargo, los estudios iniciados por Matoušek et al. (2000) y recientemente confirmados por Cox & Jones (2010) y Lambert et al. (2012), encontraron que algunos aislamientos de PVSO tenían la capacidad de inducir síntomas en hojas no inoculadas de C. quinoa, aunque se desconoce hasta el momento la existencia de aislamientos de PVSA que sólo induzcan lesiones locales en este hospedante.

Los resultados de diversidad viral de PVS encontrados en este estudio, ameritan continuar con el proceso de secuenciación de todo el genoma en al menos una cepa colombiana representativa de los tres clados hallados en el análisis filogenético, de manera que sea posible una comparación global con los aislamientos completamente secuenciados de este virus en otros lugares del mundo (Matoušek et al. 2000, Lin et al. 2009). Esto servirá como base para el diseño de herramientas de diagnóstico molecular que cubran el rango de variantes de este virus en el país y puedan posteriormente utilizarse en programas de mejoramiento genético por resistencia a virus, certificación de semilla y vigilancia cuarentenaria. Adicionalmente, es necesario evaluar si tal diversidad presenta correlaciones con las características patogénicas de las variantes de PVS sobre las variedades de papa cultivadas en el país, aspecto que requiere ser abordado con prontitud.
El hecho que en Colombia aparentemente prevalezcan  cepas  de  la raza PVSA,  implica que además de la transmisión por contacto y por tubérculo-semilla que presenta este virus, su dispersión por diferentes especies de áfidos (Wardrop et al. 1989), puede jugar un papel importante en la distribución del virus dentro y entre los lotes de cultivo de las diferentes regiones cultivadoras de papa del país.

Los hallazgos presentados en este trabajo y  otros  realizados  recientemente  para  PVY y PLRV (Gil et al. 2011a, b), indican que es necesario emprender acciones de manejo que reduzcan los niveles de infección de virus en los cultivos de papa de Colombia, siendo la aplicación efectiva del programa de certificación de tubérculo-semilla, el manejo integrado de insectos vectores, la eliminación de focos de infección en los cultivos y la vigilancia cuarentenaria apoyada con el uso herramientas  de  detección  asintomática  de  virus,  cuatro aspectos fundamentales para garantizar la sanidad viral de los cultivos de papa de este país suramericano.

Agradecimientos

Esta investigación se realizó gracias al apoyo económico del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia (proyecto 090-2007S4527-87-08). Se agradece a Luz Estela Lagos por su apoyo con la recolección de muestras en el Departamento de Nariño.




Referencias

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*Correspondencia a:
José Fernando Gil.
Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; josefergil@gmail.com. José Miguel Cotes. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Departamento de Ciencias  Agronómicas, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; jmcotes@unal.edu.com.
Mauricio Marín.
Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; mamarinm@unal.edu.com.
1. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Laboratorio de Biología Celular y Molecular, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; josefergil@gmail.com, mamarinm@unal.edu.com
2. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Departamento de Ciencias  Agronómicas, Cra 64 x Calle 65, Autopista Norte, Medellín, Colombia; jmcotes@unal.edu.com

Recibido 19-IV-2012.    Corregido 20-IX-2012.    Aceptado 18-X-2012.

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