Quantification of viral hepatitis type B using the real-time PCR technique

Elizabeth Rojas-Cordero*+

Descriptores: HBV PCR, ABI PRISM 700 Sequence Detection System.

Abstract: The polymerase chain reaction technique (PCR) has determined a special advance in the virus quantification for the management of chronic viral infections, especially for HIV hepatitis virus type B and C. The real-time quantification is performed in the ABI PRISM Sequence Detection System. The fragment pb of the genome of the hepatitis type B virus is amplified. The HBV PCR kit is recommended for taking a sample and a protocol for storing it is determined. It is important to know that freezing the samples or keeping them for a long time decreases the sensitivity of the method. It may be stored for years if kept at a temperature of -70° C. Heparinized patients or tubes with heparin will alter the determination of the sample. The lower limit of detection of B virus is 3.78 Ul/ml and the higher limit is 1.4 x 10¹¹ Ul/ml. All genotypes from A-H are determined. The patients with HbeAg positive usually present higher values than 1 x 10⁶ Ul/ml and the HBe negative inactive carriers usually get lower values than 1 x 10⁴.

Key words: HBV PCR, ABI PRISM 700 Sequence Detection System.

El ADN del VHB en suero o plasma puede cuantificarse mediante la amplificación del ácido nucleico o por tecnologías de amplificación de señal. El ensayo Abbott Real Time HBV utiliza la tecnología de PCR (reacción en cadena de polimerasa) junto con la detección de fluorescencia homogénea en tiempo real para la cuantificación del ADN del VHB. La selección de una región altamente conservada en el gen de superficie permite la detección de los genotipos A-H. La localización de la región diana en el tercio N terminal del gen de superficie garantiza que el ensayo no se vea afectado por los mutantes YMDD, los mutantes de escape del HbsAg o los mutantes resistentes a los fármacos, ya que esta región es imprescindible para la unión y secreción de partículas subvíricas y tolera solo cambios estructurales mayores.

El ensayo Abbott Real Time HBV utiliza PCr para generar producto amplificado del genoma ADN del virus en muestras clínicas. Al comienzo de la preparación de la muestra se introduce una secuencia de ADN no relacionado con la secuencia diana de la muestra del VHB a cada muestra.

Esta secuencia no relacionada de ADN se amplifica simultáneamente por PCR y sirve como control interno (IC) para demostrar que el proceso se ha realizado correctamente para cada muestra. La cantidad de secuencia diana del VHB presente en cada ciclo amplificación se mide mediante el uso de oligonucleótidos marcados con fluorescencia hibridados específicamente al producto amplificado. El ciclo de amplificación realizado por el sistema Abbott m 2000 rt detecta una señal fluorescente que es proporcional al Log de la concentración de ADN del VHB presentes en la muestra original.

Los resultados pueden ser reportados en Unidades Internacionales por mililitro (UI/ml) o Log UI/ml o bien copias por mililitro (copias/ml) o Log copias/ml. El factor de conversión es 1 UI=3.41 copias. El intervalo lineal del análisis es de 10 a 1 billón UI/ml

Recolección y almacenamiento y transporte de muestras, el análisis de carga viral de HCV, HBV y genotipaje HCV.

1-Muestras de plasma humano, recogidos con EDTA a ACD con un mínimo de 2.3ml (2 tubos morados).

2-Las muestras se pueden almacenar de la siguiente manera:

Antes de centrifugar:

15°C-30°C ---Hasta 6 horas

2°C-8°C—Hasta 24 horas

Después de centrifugar:

15°C — 30°C ---Hasta 24 horas

2°C — 8°C ---Hasta 5 días

Velocidad de centrifugación: 2000g (4400 r.p.m) por 5 minutos

3-Para el almacenamiento prolongado se recomienda temperaturas de -20°C o inferior:

4-Evitar someter las muestras a múltiples ciclos de congelación y descongelación, máximo 3 veces antes de procesar.

5-Se recomienda la separación de muestras en cámara de flujo laminar.

6-Se recomienda utilizar puntas de pipeta estériles, con filtro y libres de RNAsas.

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*Laboratorio de Biología Molecular, Hospital San Juan de Dios.

Abreviaturas: PCR, reacción en cadena de la polimerasa; IC: control interno.