Misael Chinchilla-Carmona^1,3, Olga Marta Guerrero Bermúdez¹, Giselle Tamayo-Castillo^2,4, Ana Sittenfeld Appel^2,5, Alberto Jiménez-Somarribas² & Idalia Valerio-Campos³

1 Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Departamento de Parasitología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica 2060 San José, Costa Rica; abriceno@racsa.co.cr

2 Unidad de Bioprospección, Instituto de Biodiversidad (INBio); gtamayo@inbio.ac.cr

3 Departamento de Investigación, Universidad de Ciencias Médicas (UCIMED); chinchillacm@ucimed.com

4 Escuela de Química, Universidad de Costa Rica.

5 Centro de Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica.

Abstract: Natural concentration of antimalaric components in Tropical arthropods (in vitro). Alcohol, hexane and dichlorometane extracts of 751 samples of Costa Rican arthropods were studied for the presence of antimalaric components. With Plasmodium berghei we set an in vitro model in which the effect of the extract was determined by staining of the parasites with cresil brilliant blue. Active extracts at concentration of 50 mg or less, were considered positive. Promissory extracts were found in the orders Lepidoptera (24.1%), Coleoptera (32.8%), Hemiptera (38.5%) and Polydesmida (81.3%). Since most of the Lepidoptera samples were in the immature stages, the relation with the host plant was analyzed. Cannaceae, Flacourtiaceae, Crisobalanaceae, Lauraceae, Fagaceae, Ulmaceae, Rosaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Lauraceae and Caprifoliaceae were related with the Lepidoptera larvae, and an antimalaric effect has been reported in most of these families. In the orders Polydesmida, Opiliones and Blattodea, the extract from adults also had some important effect, probably because all of them fed on plants. Polydesmida and Opiliones have chemical substances that probably serve as defensive purposes; these chemicals could also have some antiparasitic effect. Therefore, the detection of antimalaric components in arthropod species led to the identification of plants with promissory antimalaric components. Rev. Biol. Trop. 56 (2): 473-485. Epub 2008 June 30.

Key words: malaria, arthropod extracts, antimalaric activity, treatment.

La malaria es una enfermedad cuya importancia en la salud humana data de hace muchos años y continúa siendo un flagelo de la humanidad (Bioland 2001). La cantidad de muertes debidas a ella, especialmente causadas por la especie Plasmodium falciparum, es un motivo de preocupación en los países tropicales (WHO 2000).

En Costa Rica, como consecuencia de la lucha contra esta parasitosis que se llevó a cabo en los años 60, 70 y 80, ésta se consideró prácticamente erradicada (Vargas 2001); sin embargo, después de 1990 se observó un nuevo incremento en el número de casos probablemente debido a los procesos de inmigración poco controlados. Independientemente de la causa, esta enfermedad todavía permanece en Costa Rica, como en muchas otras partes del mundo (Bioland 2001). Estos hechos mantienen vigente la importancia, no sólo de una vigilancia epidemiológica sostenible, sino de la aplicación de los tratamientos más adecuados.

Dentro de la gran cantidad de drogas que se usan contra la malaria, resaltan la cloroquina, la quinina y los antifolatos sulfas y pirimetamina (Rosenthal 1998, Marquiño et al. 2003). Esta situación persiste a pesar de los más recientes intentos de encontrar productos sintéticos, capaces de actuar a niveles más puntuales de acción, específicamente en la constitución molecular del parásito, así como al proceso metabólico en cuanto a la actividad enzimática se refiere (Nzila et al. 2005a, Nzila et al. 2005b).

La quinina que es un producto natural, sólo se usa en casos muy especiales debido a sus efectos secundarios, mientras que el parásito ha desarrollado resistencia a la cloroquina y más recientemente a las sulfas (Bioland 2001, Hastings 2004, Hyde 2005). Estas razones han inducido a la búsqueda de medicina alternativa, usando productos naturales obtenidos fundamentalmente de plantas (Murphy 1999, Bodeker 2000, Anthony et al. 2005, Basso et al. 2005, Kvist et al. 2006).

Siguiendo esta línea de pensamiento se aprovechó una intensa recolecta de material entomológico realizado por el Instituto Nacional de Biodiversidad de Costa Rica (INBio), tendiente especialmente a realizar un inventario de artrópodos de este país y de paso, obtener algunos productos activos de tipo bactericida, antiviral y reguladores inmunológicos, entre otros (Sittenfeld et al. 1999, Nielsen et al. 2004). Usamos una mínima parte de ese material para estudiarlo en forma experimental por su actividad contra agentes de la malaria, utilizando para ello la especie Plasmodium berghei de naturaleza netamente murina.

Basados en estudios previos con extractos de plantas (Castro et al. 1996, Chinchilla et al. 1998) y con la experiencia obtenida al desarrollar técnicas para el análisis de extractos de artrópodos (Chinchilla et al. 1998, Chinchilla et al. 2001) se estudiaron gran cantidad de familias y órdenes de artrópodos en busca de principios activos antimaláricos.

El estudio pretende no sólo dar a conocer un trabajo de más de 4 años, sino establecer alguna relación entre el extracto que presente algún efecto promisorio y la planta hospedero del cual se alimenta el artrópodo. La comunicación de los resultados constituye la meta fundamental de esta publicación.

Recolecta y procesamiento de los artrópodos capturados. De acuerdo con los métodos de campo descritos previamente (Sittenfeld et al. 1999, Nielsen et al. 2004), se recolectaron ejemplares de los órdenes y familias que se indican en el cuadro 1 para un total de 751 muestras.

Para obtener el material, que luego se probó para demostrar su posible actividad antimalárica, se utilizaron extractos hexánicos y alcohólicos obtenidos con las técnicas descritas previamente (Chinchilla et al. 2001).

Análisis de laboratorio. La determinación del efecto antimalárico de cada extracto fue realizado in vitro de acuerdo con el procedimiento previamente descrito (Chinchilla et al. 2001) y que se explica brevemente. Ratones NGP (20-30 g) fueron inoculados i.p. con glóbulos rojos infectados con Plasmodium berghei; 8 días después los animales fueron sangrados de la cola y se preparó una suspensión con 3% a 5% de glóbulos rojos suspendidos en MEM más 10% de suero fetal bovino. El uso de P. berghei para este estudio se basa en las recomendaciones hechas por varios autores (Carter y Diggs 1977, Janse y Waters 2006). El extracto liofilizado fue disuelto en DMSO al 10% de manera que se obtuviera una concentración de 1:10 (peso/volumen). Luego se realizaron diluciones dobles de cada extracto, incorporando a 50 µl de cada dilución, 200 µl de la solución de eritrocitos infectados. Las muestras se incubaron a 37 °C por 2 horas usando los controles negativos y positivos correspondientes. La muerte de los parásitos fue determinada usando el colorante azul de cresil brillante al 1%, estableciendo el 50% o más de organismos teñidos como signo de positividad.

Análisis experimental. Para realizar un estudio que cubriera la mayoría de los parámetros considerados, se separaron las muestras de acuerdo con el tipo de extracción (alcohólica o hexánica), los órdenes y familias correspondientes a la actividad de cada extracto y el tipo de estado evolutivo o productos estudiados en cada caso.

Luego se trató de establecer una relación entre de los estractos de artrópodos "promisorios" y las plantas de las cuales se alimentan esos artrópodos.

Se consideraron extractos activos aquellos en que el efecto antimalárico pudo ser demostrado en 5 o menos de 5mg /ml. Extractos que fueron activos en concentraciones de más de 5 y hasta 50 mg/ml, se consideraron parcialmente activos. Para establecer todas las relaciones del caso y ordenar todos los datos obtenidos se usó el programa SPSS-13.0.

El cuadro 2 indica los porcentajes de extractos con alguna actividad antimalárica en los diferentes órdenes de artrópodos estudiados, de acuerdo con el tipo de extracción (alcohólica o hexánica y diclorometánica). Como esperado, los porcentajes de positividad son muy bajos, siendo el más alto el del orden Lepidoptera del que además se estudiaron mayor número de muestras.

Al establecer las categorías de activo (5 o < 5 mg/ml de actividad) y parcialmente activo (>5 a 50 mg/ml de actividad) los números se reducen totalmente como se observa en el Cuadro 3. Los porcentajes más elevados se observan en Lepidoptera y Coleoptera, ya que la extracción hexánica o diclorometánica arrojó resultados más altos de positividad.

Los cuadros 4 y 5 representan los porcentajes de muestras con alguna actividad (en general) de acuerdo con los materiales estudiados en los diferentes órdenes a saber: formas adultas, estadíos inmaduros (larvas, pupas) y algunos productos (heces fundamentalmente). En ambos tipos de extracción se observa que el número mayor de muestras positivas del Orden Lepidoptera fueron estadíos inmaduros, 19% para los extractos alcohólicos, 32.2% para los hexánicos. Siguieron los productos (heces) con 17.6% y 18.7% respectivamente y finalmente las muestras de los adultos con 7.9% y 31% de positividad. En los otros órdenes no existió un patrón tan definido.

Al analizar las familias del orden Lepidoptera, se encontró un mayor número de extractos positivos como se muestra en el cuadro 6. El mayor número de extractos positivos se encontró en la familia Saturniidae. Además se observó que un mayor número de extractos provenientes de heces y estadíos larvales y prepupales activas, eran positivos, independientemente de la familia estudiada.

En el cuadro 7 se indican las plantas hospederos de las larvas de Lepidoptera (mariposas) cuyos extractos presentaron alguna actividad antimalárica importante. En este caso se encuentra un gran variedad de familias de plantas asociadas con los insectos en estudio.

Finalmente la relación entre las familias de plantas de hospederos y los materiales provenientes de las mariposas encontrados positivos se establecen en el cuadro 8. De nuevo son los estados inmaduros los que predominan en su relación con casi todas las plantas, siguiéndole las heces de estas larvas. Adultos y pupas estuvieron relacionadas con muy pocas familias.

El estudio completo del que se originó este trabajo tenía como principal objetivo determinar la presencia de productos activos contra la malaria y otros organismos en un buen número de géneros y especies de artrópodos (Sittenfeld et al.1999, Nielsen et al. 2004).

Sin embargo al analizar los resultados se notó una tendencia interesante en el sentido de que el hallazgo de actividad antimalárica encontrada en el artrópodo no era quizá lo más importante. Más bien, la acción clave está en el papel de esos organismos como herramienta de concentración de los productos provenientes de las plantas que ingieren y digieren.

En el cuadro 1 se muestra que los porcentajes más altos de positividad se encontraron en Lepidoptera (24.1%), Coleoptera (32.8%), Hemiptera (38.5%) y Polydesmida (81.3%). Adultos y formas inmaduras de todos estos órdenes basan su alimentación en plantas superiores (Diniz et al. 2002) o inferiores (Venkatesha 2005) muchas de las cuales se han relacionado con alguna acción contra organismos infecciosos (Antony et al. 2005) e inclusive propiamente contra malaria (Véanse referencias en cuadro 9).

Se encontró que los extractos hexánicos o diclorometánicos presentaron mayor actividad antimalárica que los alcohólicos (cuadros 2 y 3) lo cual concuerda con los hallazgos de otros investigadores (Gómez y Witte 2001, Nielsen 2004), probablemente porque un mayor número de componentes químicos activos contra malaria tales como derivados de ácidos grasos y terpenoides se encuentran en los de extractos hexánicos (Murphy 1999, Nielsen 2004) y no en los alcohólicos. Dentro de los extractos de Lepidoptera en que se encontró mayor actividad antimalárica (cuadro 3), se observan aquellos provenientes de estadíos inmaduros, fundamentalmente larvas y heces de estas larvas, tal y como se demuestra en los cuadros 4, 5 y 6. Esto se explica porque los estadíos larvales son los que se alimentan directamente de hojas de las plantas y entonces la concentración de estos materiales por el insecto serían probablemente los responsables de esta actividad antimalárica (Referencias en cuadro 9); las heces son el producto de la digestión de esas hojas.

Llama la atención la positividad encontrada en los adultos del orden Polydesmida, familia Rhacodesmidae y del orden Opiliones. Los organismos del primer orden, los llamados milpiés, se alimentan de hojas secas o descompuestas de muchas plantas inclusive de la familia Meliaceae, (Cárcamo et al. 2000), la cual presenta algunos géneros con actividad antimalárica (Chinchilla et al. 1996). Además varias especies de este orden secretan sustancias de defensa (Cárcamo et al. 2000) cuya composición química podría ser la causante del efecto indicado. En cuanto a las especies del orden Opiliones, se ha encontrado que estos organismos se alimentan de varias especies de artrópodos dentro de los que se incluye larvas y adultos de lepidópteros, coleópteros y hemípteros fítófagos (Lawrence 1981, Santos et al. 2002), por lo cual estos podrían ser la fuente indirecta de productos activos provenientes de plantas. También sabemos que estos organismos producen sustancias de defensa dentro de las que se incluyen alcoholes, cetonas y quinonas (Kerzicnik 2001). Estos datos permiten orientar el trabajo hacia las plantas, de las que se nutren las formas inmaduras de las mariposas, además de la posibilidad de que las sustancias de defensa de los hospederos sean las causantes del efecto antimalárico. La positividad encontrada para extractos de adultos de Blattodea y Coleoptera (Cuadro 1) y su relación con plantas puede explicarse de la siguiente manera. Las especies de la primera familia (las cucarachas) son omnívoras y dentro de lo que ingieren están materiales provenientes de troncos y hongos en descomposición, lo que de nuevo indicaría que es en las plantas en donde existen compuestos con el efecto estudiado. En cuanto a los abejones (orden Coleoptera) una gran mayoría se alimentan de plantas de las cuales absorben su savia. Específicamente en el Orden Lepidoptera se determinó la relación de sus familias y géneros con diversas familias y especies de plantas hospedero (Cuadro 7) las cuales se relacionan también en mayor grado con larvas y heces de las mariposas (Cuadro 6). El hecho de que la acción antimalárica de estos extractos pueda deberse a la relación alimentaria de los insectos con las plantas hospedero se evidencia en el cuadro 9 en donde se relacionan algunas de esas familias, e inclusive géneros de las mismas, con actividad antimalárica (Referencias en cuadro 9).

Además, en los informes antes mencionados se indica que la actividad antimalárica fue encontrada en extractos de hojas de las familias Malvaceae, Acanthaceae, Rutaceae, Myrtaceae, Solanaceae, Fabaceae, Urticaceae y Anacardiaceae. En el caso de las familias Euphorbiaceae y Asteraceae la actividad fue encontrada en toda la planta incluyendo las hojas. Éstas son precisamente el alimento de las formas larvales de Lepidoptera.

De esta manera se llega en forma indirecta a descubrir a través de los artrópodos estudiados, familias, géneros y aún especies de plantas con actividad antimalárica. Queda por determinar si los insectos son simples encargados de concentrar los productos activos antimaláricos, si además metabólicamente pueden transformar los componentes químicos de la planta para dar un producto antimalárico, o en última instancia, ocurren ambos fenómenos, dependiendo de las familias de insectos y de la planta hospedero. En algunas familias de plantas (Cannaceae, Flacourtiaceae, Crisobalanaceae, Lauraceae, Fagaceae, Ulmaceae) a las que llegamos a través de su relación con las larvas de Lepidoptera (Cuadro 7 y 8), no encontramos referencia de actividad antimalárica. En estas plantas debemos enfocar también las investigaciones pues la confirmación de esta actividad podría presentar un nuevo aporte al conocimiento de los productos naturales efectivos contra Plasmodium. Además, merecen un estudio más detallado las sustancias de defensa producidas por las especies de los órdenes Polydesmida y Opiliones. Estudios para dilucidar estos aspectos se están iniciando.

Este estudio fue realizado gracias al apoyo económico del Nacional Institute of Health (Fogarty Internacional Center), proyecto N° 5U01TW/CA00312 y de la Vicerectoría de Investigación de la Universidad de Costa Rica, proyecto N° 801-96-582. Toda la actividad secretarial y ordenamiento de los resultados del trabajo fue realizado en el Departamento de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas (UCIMED).

Resumen

Extractos alcohólicos, hexánicos y diclorometánicos de 751 muestras de artrópodos fueron estudiados por la presencia de actividad antimalárica. En este trabajo se empleó un modelo murino usando el Plasmodium berghei, modelo que es biológicamente similar a la malaria humana. El estudio fue realizado determinando el efecto del extracto sobre el parásito por la inclusión o no del colorante azul de cresil brillante. Estimando como positivos aquellos extractos cuya actividad antimalárica se mostró en concentraciones no mayores de 50 mg, se encontró que los órdenes más promisorios fueron Lepidoptera (24.1%), Polydesmida (81.3%), Blattodea (25%) y Opiliones, entre otros. Las formas inmaduras de Lepidoptera fueron las más positivas, por lo que se analizaron las plantas hospederos de donde se alimentaban dichos organismos. Las familias de estas plantas eran Malvaceae, Acanthaceae, Rutaceae, Myrtaceae, Solanaceae, Fabaceae, Urticaceae, Anacardiaceae, Rosaceae, Asteraceae, Rubiaceae, Lauraceae y Caprifoliaceae. Especies de casi todas estas familias han sido reportadas con actividad antimalárica. En el caso de los órdenes Polydesmida, Opiliones y Blattodea, cuyas formas adultas presentaron alguna actividad contra P. berghei, encontramos que todos esos grupos se alimentan también de plantas. En el caso de Opiliones sus especies son predadores de lepidópteros, coleópteros, hemípteros fitófagos y otros artrópodos, además de que producen sustancias de defensas tales como alcoholes, cetonas y quinonas, entre otros, todo lo cual podría explicar la actividad encontrada. Algunas especies del Orden Polydesmida, también secretan ciertas sustancias químicas, las cuales podrían tener un efecto antiparasitario. Así, a través de este trabajo en artrópodos hemos llegado a identificar fuentes vegetales potenciales para componentes antimaláricos.

Palabras claves: malaria, extractos de artrópodos, actividad antimalárica, tratamiento.

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