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Las palomas, por lo general, han sido consideradas como símbolo de paz. La paloma de Castilla (Columba livia) es considerada un animal inofensivo y uno de los que tiene mayor contacto con los humanos, no obstante, son potenciales transmisores de enfermedades y causantes del deterioro de monumentos y edificios en ciudades de todo el mundo.1,2,3 Esta especie de paloma porta 60 diferentes organismos patógenos, de los cuales, cinco son transmitidos a seres humanos con regularidad. Entre esos cinco, el complejo de especies Cryptococcus neoformans (conformado por C. neoformans sensu stricto, anteriormente conocido como C. neoformans var. grubii y por C. neoformans, anteriormente C. neoformans var. neoformans) ocupa el segundo lugar en frecuencia.2,4,5
Esta levadura patógena es causante de la criptococosis, una micosis oportunista cuyos síntomas más notorios para la forma meníngea son dolor de cabeza y disturbios visuales. Dado que generalmente la criptococosis se manifiesta en personas inmunodeficientes, se le considera una enfermedad asociada con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) por lo que deben indicarse pruebas para detectar al Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) siempre que se aísla una especie perteneciente al complejo de especies C. neoformans a partir de muestras clínicas.6, 7 En algunos pacientes existen ciertas condiciones (como criptococemia y presión intracraneal alta) que elevan la probabilidad de que la criptococosis resulte mortal.7 En El Salvador, se registraron más de 500 casos de criptococosis entre 2009 y 2019; de éstos, 43 fueron casos fatales (Ministerio de Salud de El Salvador).
A pesar de que se desconocen los sitios de contagio y el vínculo de esta especie de paloma con casos como estos, los lugares públicos frecuentados por ellas podrían ser potenciales focos de contagio.
Por tanto, dado que los lugares públicos visitados en este estudio son frecuentados por un gran número de personas para diversas actividades, el riesgo de exposición podría representar un peligro para la salud de las personas, especialmente de personas inmunodeficientes. El objetivo del estudio fue aislar levaduras pertenecientes al complejo de especies C. neoformans de los excrementos de paloma de Castilla (C. livia), por medio de muestras recolectadas en una selección de parques y plazas públicas de El Salvador.
Métodos
Recolección de las muestras: Esta investigación fue observacional, cualitativa; los sitios de estudio se eligieron a conveniencia. La recolección de las muestras fecales de paloma de Castilla (C. livia), se realizó en lugares con una gran afluencia de personas y palomas (atrio de catedrales, plazas y parques públicos) a través de los ocho departamentos más densamente poblados de El Salvador, según el último censo poblacional llevado a cabo por la Dirección General de Estadísticas y Censos en 2008, los cuales son: San Salvador, La Libertad, Santa Ana, Sonsonate, San Miguel, Usulután, La Paz y Cuscatlán (Figura 1).
Figura 1 Ubicación de parques y plazas públicas visitados para la recolección de las muestras de excremento de la paloma de Castilla (Columba livia). 1) Catedral de Santa Ana, 2) Parque El Calvario, 3) Parque Rafael Campo, 4) Parque San Martín, 5) Parque Daniel Hernández, 6) Plaza Gerardo Barrios, 7) Plaza Libertad, 8) Parque central de Suchitoto, 9) Plaza Cívica de Zacatecoluca 10) Parque central de Usulután y 11) Parque Guzmán.
Se recolectaron excrementos siempre que hubo comprobación efectiva de que pertenecían a palomas de Castilla (C. livia). Se tomaron en cuenta aspectos como la morfología de los excrementos de esta especie para evitar recolectar material fecal de otra especie. Cada sitio de estudio se visitó durante el transcurso de la mañana, desde la 7:00 a. m y hasta las 12:00 m. Se utilizaron pequeñas espátulas plásticas estériles, una por cada muestra recolectada. Se tomaron dos muestras de excrementos por sitio. Se realizaron tres viajes de recolecta a cada sitio cada dos semanas. Todas las muestras obtenidas mediante la recolección con la espátula se depositaron en bolsas plásticas estériles Ziploc® y se transportaron en un contenedor plástico seco el mismo día o el día posterior de su recolección hacia los laboratorios del Centro de Investigaciones y Desarrollo en Salud ubicado en las instalaciones de la Universidad de El Salvador para ser procesadas.
Aislamiento del complejo C. neoformans:
Para aislar e identificar al complejo C. neoformans, se siguió la metodología detallada en un estudio previo en El Salvador.8 Primero, se colocaron las excretas en un frasco con 30 mL de solución salina al 0.85%. Luego este se depositó en un agitador magnético, se revolvió el contenido por 10 minutos y se dejó sedimentar. Posteriormente, se tomó 1.0 mL del sobrenadante y se diluyó en otro frasco que contenía 9 mL de solución salina al 0.85%. Se tomó 0.1 mL de los 10 mL resultantes y se colocó sobre cajas Petri con Agar Semilla de Girasol expandido con una espátula de Driglaski; este es un medio de cultivo selectivo y diferencial, simple de preparar y sin mayores costos.9.
Seguidamente, se incubó a 37 °C de 3 a 7 días.Se tomaron muestras de las colonias circulares cafés que crecieron en el Agar Semilla de Girasol y se sembraron en tubos de ensayo con Agar Glucosado Sabouraud en biselado mediante la técnica de estriado con un asa y se incubaron a 28°C. Las colonias sospechosas se enviaron a la Sección de Micología Médica de la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica para la confirmación de la especie. A fin de preparar los aislamientos para su envío, se tomó una muestra de las colonias sospechosas en Agar Glucosado Sabouraud y se colocó en un tubo cónico de 1.5 mL con un 1.0 mL de solución salina estéril al 0.85% y debidamente rotulado.
Caracterización fenotípica de los aislamientos de Cryptococcus: En la Sección de Micología Médica de la Universidad de Costa Rica, a los aislamientos sospechosos se les practicó una serie de pruebas fenotípicas con el fin de verificar su pureza y la correcta clasificación dentro del complejo C. neoformans. Se les efectuó una tinción negativa con tinta china, fueron inoculados en Agar Urea de Christensen, en agar L-Dopa y en agar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB). Además, se les realizó una determinación del perfil bioquímico con API® 20 C AUX (BioMérieux, Francia).
Caracterización genotípica de los aislamientos de Cryptococcus: Para la caracterización genotípica de los aislamientos de Cryptococcus, se siguió la metodología descrita por Jaikel-Víquez y colaboratodores10: una extracción de ADN genómico por medio de la técnica de choque térmico. La tipificación se ejecutó con la técnica de RFLP del gen URA5, con las enzimas Sau96I y HhaI (Thermo Scientific, Estados Unidos), utilizando los imprimadores URA5 (5' ATG TCC TCC CAA GCC CTC GAC TCC 3') y SJ01 (5' TTA AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC 3'). Como controles positivos se recurrió a las cepas de Cryptococcus WM 148 (VNI), WM 626 (VNII), WM 628 (VNII), 629 (VNIV), WM 179 (VGI), WM 178 (VGII), WM 161 (VGIII) and WM 779 (VGIV), del Westmead Institute for Medical Research, de Sydney, Australia.
Resultados
Se analizó un total de 66 muestras de excrementos, de las que se aislaron ocho colonias sospechosas. De estas ocho, solo a tres se les observó cápsula, hidrólisis de la urea y producción de melanina; por lo tanto, fueron clasificadas preliminarmente como Cryptococcus sp. Tras el perfil bioquímico, se determinó que los aislamientos pertenecían a los complejos de especies C. neoformans y C. gattii. A través del empleo del crecimiento en CGB se corroboró la clasificación dentro del complejo de especies C. neoformans.
Mediante la restricción enzimática, se identificó la especie y el tipo molecular con los siguientes patrones de restricción: VNI (muestras 39 y 45) y VNII (muestra 58), como se muestra en la figura 2; siendo dos de los tres tipos moleculares conocidos del complejo C. neoformans y ambos pertenecen a la especie C. neoformans sensu stricto.
De los 11 sitios estudiados, solo en tres se encontró la presencia de C. neoformans sensu stricto, estos lugares fueron: Parque Rafael Campos (departamento de Sonsonate), Plaza Cívica (La Paz) y Parque Calvario (Santa Ana). Se encontró una muestra positiva en cada sitio; el tipo molecular VNI se encontró en la Plaza Cívica y El Calvario y la VNII en el parque Rafael Campos.
Figura 2 Genotipos de los complejos de especies C. neoformans (VNI-VNIV) y C. gattii (VGI-VGIV) y las muestras 39, 45 y 58 de excremento de la paloma de Castilla (Columba livia) recolectado en parques y plazas públicas de El Salvador, detectados según la restricción enzimática del gen URA5. WM = Hospital Westmead. Marcador de peso molecular (GeneRuler 50 pb DNA Ladder, Thermo Scientific®).
Discusión
Con el presente estudio, se identificó la presencia de C. neoformans en un 4.5% de las muestras de excremento de las palomas de parques públicos. Este resultado es comparable con estudios de Perú y México, donde se evidenció que la presencia de C. neoformans fue de 13.7% y 5% respectivamente.12,13
En un estudio previo llevado a cabo en El Salvador, se aisló el hongo en 36.5% de las muestras analizadas.8
En este, los autores analizaron muestras provenientes de lugares públicos y también provenientes de nidos de palomas; todas las muestras analizadas provenientes de nidos resultaron positivas. Sin embargo, en el presente estudio no se analizaron muestras provenientes de nido.8,11,13. Se ha observado que los estudios con alto porcentaje de aislamiento de C. neoformanshan obtenido muestras de nidos o palomas enjauladas, donde los excrementos se acumulan y hay más probabilidades de que C. neoformans se desarrolle.13,14
Como se ha mencionado, este estudio examinó muestras del suelo o repisas de monumentos y estructuras de los parques y plazas, que se encuentran más cerca de las personas que visitan estos lugares, por esa razón no se tomaron muestras de nidos. El piso (o superficies expuestas) de los parques y plazas que reciben buena radiación solar y altas temperaturas, como la mayoría de los sitios muestreados para esta investigación, son poco propicios para que en los excrementos de paloma se desarrolle C. neoformans.15,16,17,18 Los factores ambientales y la limpieza llevada a cabo en algunos parques (lo que previene la acumulación de excrementos) ayudan a explicar el hecho que solo en tres de 66 muestras fuera posible confirmar la presencia de esta levadura.
En cuanto a los genotipos encontrados, los hallazgos de este estudio concuerdan con el hecho de que la especie C. neoformans (VNI y VNII) es la especie del complejo que más prevalece en el ambiente; además, fue la aislada con mayor frecuencia en un estudio que analizó muestras de varios países de América Latina: 93.3% en Guatemala y 69.6% en México.19 Su relevancia en materia de salud pública es que esta variedad es la causante de la mayoría de casos de criptococosis en el mundo y de la mayoría de las criptococosis en pacientes con SIDA.19,20,6
Los hallazgos en este estudio permiten sugerir que factores como la radiación solar y la limpieza no dejan mucho margen al desarrollo de C. neoformans sensu stricto. Aunque en este estudio no se cuenta con datos ambientales para analizar cómo estos factores influyeron en la presencia de esta levadura, ciertamente las personas inmunodeficientes podrían ver en riesgo su salud al visitar lugares con presencia de esta paloma y con poca radiación solar o limpieza. Sin duda, futuros estudios podrían evaluar la relación entre esta levadura y los factores ambientales en lugares públicos; por lo que es importante seguir profundizando en los estudios sobre los espacios públicos y esta especie de paloma, con el propósito de disponer de más elementos objetivos que contribuyan a mejorar las políticas de salud pública en centros urbanos, donde cientos de individuos de esta especie de paloma interactúan a diario con las personas que residen en ellos.
