Revista Tecnología en Marcha

Presentación

Culture of human skin cells on both artificial polymeric and porcine-urinarybladder-derived acellular scaffolds

Resumen La ingeniería de tejidos aplicada a lesiones de la piel propone constantemente métodos innovadores con el propósito de mejorar la calidad de vida de las personas con estas patologías. El objetivo de este estudio fue cultivar fibroblastos y queratinocitos humanos sobre soportes artificiales poliméricos termosensibles y membranas acelulares derivadas de vejiga porcina. Se establecieron cultivos primarios y subcultivos y, subsecuentemente, se obtuvieron epidermis diferenciadas y estratificadas a partir de queratinocitos que crecieron en cocultivo con una capa alimentadora (feeder layer) de fibroblastos dérmicos humanos. Mediante microscopía óptica, se efectuaron observaciones relacionadas con el crecimiento y la diferenciación de ambos tipos celulares. Se encontró que las células epiteliales cultivadas sobre soportes termosensibles produjeron láminas epidérmicas bastante semejantes a una epidermis natural, mientras que la membrana acelular derivada de vejiga porcina resultó menos exitosa para el desarrollo de queratinocitos.

Abstract Innovative methods are constantly proposed by tissue engineering in order to improve the quality of life of people affected by skin injuries. The aim of this study was the in vitro culture of human fibroblasts and keratinocytes on both artificial polymeric thermosensitive and porcineurinary-bladder-derived acellular scaffolds. Primary cultures and subcultures were established and, subsequently, differentiated and stratified epidermises were obtained from keratinocytes co-cultured with a human dermal fibroblast feeder layer. Observations on both structure and differentiation of keratinocytes and fibroblasts were performed by optical microscopy. It was observed that epithelial cells cultivated on thermosensitive scaffolds were able to produce epidermal sheets similar to normal epidermis, whereas keratinocyte development was less successful on the porcine-urinary-bladder-derived acellular membrane.

X-ray subletal irradiation of murine 3T3 fibroblasts for feeder-layer

Resumen Los queratinocitos, las principales células de la epidermis, requieren una capa alimentadora de células viables mitóticamente inactivadas para su supervivencia y proliferación in vitro. Para la producción de capas alimentadoras a partir de fibroblastos murinos 3T3, se evaluaron cuatro dosis de radiación con rayos X. Los efectos de las dosis se evaluaron mediante recuentos celulares y determinación de la viabilidad (MTT), adhesión (eficiencia de plateo) y migración celular (scratch wound healing). Además, se encontraron evidencias que sugieren el arresto mitótico mediante una tinción nuclear (GIEMSA). Se observó que una dosis de radiación correspondiente a 80 Gy generó daños suficientes en la línea celular para causar el arresto mitótico, manteniendo a la vez la actividad metabólica basal durante 25 días.

Abstract Keratinocytes, the main cells of the epidermis, require mitotically inactive but live feeder-layer cells for their survival and proliferation. We evaluated four X-ray irradiation doses on 3T3 murine fibroblasts for feeder-layer production. Each dose effect was evaluated by cell counting and cellular viability determination (MTT), cell adhesion (plating efficiency) and cell migration (scratch wound healing). Mitotic arrest was suggested by nuclear staining (GIEMSA). We determined that an 80 Gy X-ray dose generated enough cell damage to cause mitotic arrest yet keeping metabolically active cells up to 25 days.

Culture of canine epithelial cells for veterinarian therapy

Resumen En este artículo se presenta el caso clínico de un paciente canino con un trauma a nivel de piel, que fue tratado mediante un trasplante heterólogo en una matriz gelificada de fibrinógeno con fibroblastos cultivados in vitro. La aplicación de fibroblastos en el paciente logró una mejoría notoria con respecto a la disminución del tamaño de la herida y la ausencia de reacciones alérgicas y efectos adversos frente al tratamiento. Esta experiencia abre las puertas para un desarrollo en la investigación en el área de ingeniería de tejidos veterinaria con fines terapéuticos en Costa Rica.

Abstract We present the clinical case of a canine patient with a cutaneous trauma. The injure was treated with a heterologous transplant of in vitro cultured fibroblasts on a fibrinogen-based matrix gel. This resulted on a noticeable reduction on the wound size and the patient did not present any allergic reactions or adverse effects to the treatment. This experience opens an opportunity for the development of the veterinary Tissue Engineering area with therapeutic applications in Costa Rica.

In vitro culture of epithelial autografts for treating skin ailments

Resumen En muchos países, novedosas estrategias terapéuticas han permitido mejorar la atención y recuperación de diversos tipos de lesiones y afecciones en la piel. Sin embargo, en Costa Rica no existe, como protocolo de rutina, un tratamiento basado en ingeniería de tejidos que permita una reepitelización más efectiva y permanente en pacientes con heridas crónicas o de gran extensión en la piel. Muchos pacientes con afecciones epidérmicas podrían tratarse si existiese un programa a nivel nacional para la producción y trasplante de células de la piel que posibilite una rehabilitación menos traumática, más efectiva y con menor tiempo de hospitalización. Una opción para resolver este problema es el cultivo in vitro de células de la piel (fibroblastos y queratinocitos) para la elaboración de equivalentes dermoepiteliales para autoinjertos, un procedimiento actualmente disponible en el Laboratorio de Ingeniería de Tejidos (LAINTEC) del Centro de Investigación en Biotecnología (CIB) del Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR).

Abstract Worldwide, novel therapeutic strategies have allowed an improvement on the attention and recovery of several skin ailments. However, to date in Costa Rica, there is no treatment, as a current routine protocol, to allow more effective and permanent re-epithelization of patients with chronic or large wounds on the skin. Given the existence of a national program for the production and transplant of skin cells, many patients with skin affections could be treated in the country, with less traumatic and more effective rehabilitation, and with lesser hospital stays. One option to solve this problem, is the in vitro culture of skin cells (fibroblasts and keratinocytes) for the production of autologous dermo-epithelial equivalents for grafting, a procedure currently available at the Tissue Engineering Laboratory (LAINTEC) of the Biotechnology Research Center at the Costa Rica Institute of Technology (ITCR).

Skin grafts and substitutes developed by Tissue Engineering

Resumen La reconstrucción de tejidos y órganos mediante ingeniería de tejidos ha permitido la elaboración y comercialización de diversos sustitutos o equivalentes epiteliales, que han sido utilizados desde hace más de 30 años a escala internacional para el tratamiento de lesiones en pacientes humanos. Estos injertos o implantes se confeccionan con materiales biodegradables (naturales o polímeros sintéticos) que sirven como matrices para la adhesión y proliferación celular y pueden contener células de diversos orígenes (autólogas, alogénicas o xenogénicas). Su principal ventaja clínica consiste en proporcionar una reepitelización efectiva en lesiones de gran extensión, lo que es particularmente relevante cuando hay poco tejido disponible para hacer autoinjertos. Además, ofrecen una cobertura al lecho de la lesión, evitando la deshidratación y las infecciones microbianas. Sin embargo, aún existen numerosos retos para asegurar la funcionalidad inmediata y la permanencia a largo plazo de los implantes, así como la reproducción exacta de la estructura y fisiología normal del tejido. En Costa Rica, el Centro de Investigación en Biotecnología del Instituto Tecnológico de Costa Rica cuenta con el único laboratorio en el país dedicado al cultivo in vitro de células de piel para la reconstrucción de equivalentes epiteliales con fines terapéuticos.

Abstract Tissue Engineering strategies for tissue and organ regeneration have allowed the fabrication and commercialization of diverse skin substitutes, which have been applied in different parts of the world on human patients over the course of the last 30 years. These grafts have been developed using biodegradable materials (of natural or synthetic origin) as scaffolds for the adhesion and proliferation of cells that may be of different origins (autologous, allogenic and xenogenic). The main clinical advantage of these materials is to provide an effective re-epitelization of large wounds, which is particularly relevant when there is little tissue available for autografts. Also, skin equivalents provide coverage for skin lesions, avoiding dehydration and microbial infections. Despite these advantages, there are still many challenges to solve including the immediate functionality and long term permanency of the grafts and the exact reproduction of the normal tissue structure and physiology. In Costa Rica, the only laboratory dedicated to in vitro skin cell culture for reconstructing epithelial equivalents with therapeutic applications is located at the Biotechnology Research Center at the Costa Rica Institute of Technology.

Collagen and chitosan membranes from alternative sources: evaluation of their potential for Tissue Engineering applications

Resumen Los polímeros naturales, como el colágeno y el quitosano, presentan características físicas, químicas y biológicas que los hacen buenos candidatos para usarlos como soportes análogos de matriz extracelular, con potenciales aplicaciones en la ingeniería de tejidos. En el presente trabajo se evaluaron membranas biopoliméricas de colágeno y quitosano de material considerado tradicionalmente de desecho en la industria pesquera, para el cultivo de fibroblastos dérmicos. Se emplearon matrices de 100% colágeno, 100% quitosano y colágeno:quitosano en proporciones 8:2, 2:8, 6:4 y 4:6, obtenidos a partir fuentes alternativas (cáscara de camarón y piel de tilapia). El principal reto para el empleo de estos materiales en aplicaciones biomédicas es su esterilización, para lo cual se evaluaron diferentes métodos, incluyendo tratamientos químicos (etanol, antibióticos y acetona) y físicos (rayos X, radiación UVC). El único procedimiento que permitió la desinfección efectiva sin comprometer la integridad de los biomateriales fue la incubación con antibióticos y antimicóticos durante 48 horas. Además, se confirmó la adhesión y proliferación celular sobre las membranas. Estos resultados demostraron el potencial biomédico de estos materiales.

Abstract Natural polymers such as collagen and chitosan possess physical, chemical and biological characteristics that make them good candidates as extracellular matrix scaffolds with potential applications in Tissue Engineering. In the present work, collagen and chitosan biopolymer membranes made from waste material, were evaluated for dermal fibroblasts cell culture. Several membrane compositions were analyzed, including 100% collagen, 100% chitosan, 8:2, 2:8, 6:4, 4:6 collagen-chitosan, obtained from alternative sources (shrimp shells and fish scales). Given that sterilization is one of the main challenges for using materials and devices in biomedicine, we evaluated different methods to achieve this, including chemical (ethanol, antibiotics and acetone) and physical (X-rays, UVC irradiation) treatments. Antibiotic and antifungal immersion for 48 hours was the only procedure that allowed complete sterilization without compromising the integrity of the membranes. Also, we were able to confirm cellular adhesion and proliferation on the membranes. These results demonstrate the potential of these materials to be used as scaffolds in Tissue Engineering applications.

Evaluation of skin procurement and storage techniques for Tissue Banking

Resumen En el presente trabajo se reproducen y analizan algunas de las técnicas más comunes a nivel internacional para el manejo de piel cadavérica para bancos de tejidos. Para ello, se llevó a cabo la ablación, el procesamiento, la desinfección y el almacenamiento de piel utilizando un modelo animal (cerdo, Sus scrofa domesticus). Para verificar la calidad microbiológica del tejido se compararon dos diferentes métodos de desinfección (antibióticos y desinfección química con cloro). Además, se evaluó el efecto de dos tratamientos para el almacenamiento y conservación de la piel: inmersión en glicerol a bajas temperaturas (4 °C) y criopreservación (-70 °C). Finalmente, se analizó un método de esterilización utilizando irradiación con haz de electrones (25 kGy). La estructura general del tejido se analizó mediante tinciones histológicas. Los resultados demostraron la esterilización completa de las muestras, tanto de los tejidos irradiados como en la piel glicerolada desinfectada químicamente (solución de Dakins). Por otro lado, la comparación histológica de las muestras reveló que el tejido glicerolado fue el que mostró la mejor calidad en términos estructurales.

Abstract Here we report how we reproduced and analyzed the most common international techniques for managing skin for Tissue Banking. Skin ablation, processing, disinfection and storage were performed using an animal model (domestic pig, Sus scrofa domesticus). Two different disinfection methods were compared (antibiotics and chemical disinfection with chlorine) by evaluating the microbiology profile of the tissue. Also, two different storage and preservation treatments were compared: glycerol immersion at low temperatures (4°C) and cryopreservation (-70°C). Finally, we analyzed the sterilization of the tissue by electron beam irradiation (25 kGy). General structural changes in the tissue were analyzed by histological staining. Our results show that complete sterilization of the samples was achieved in both the irradiated tissue and in the chemically disinfected glycerolated skin (Dakins solution). Histological comparison between treatments revealed that samples kept in glycerol showed the best structural quality.